论文部分内容阅读
白介素34(Interleukin 34,IL-34)是2008年首次报道的一种新型白细胞介素,作为巨噬细胞集落刺激因子受体(Macrophage colony stimulating factor receptor,M-CSFR)的第二功能性配体,具有促进单核-巨噬细胞系统增殖与分化、诱导多种细胞因子和趋化因子生成和增加、促进炎症发生、促进破骨细胞形成等生物学功能。大量研究表明IL-34在哺乳动物中起着非常重要的免疫调控作用,但是IL-34在硬骨鱼中的功能研究少之又少,尤其是有关草鱼IL-34的研究还尚未有文献报道。本文以草鱼为研究对象:1.克隆并鉴定了IL-34基因,其cDNA全长为1792 bp,编码区(coding region sequence,CDS)包括633个核苷酸,含有6个外显子和5个内含子,编码210个氨基酸,前24个氨基酸为预测信号肽,和硬骨鱼中斑马鱼的氨基酸序列同源性高达76%,系统进化分析显示草鱼IL-34在进化中具有高度的保守性。2.通过实时荧光定量PCR(qPCR)对IL-34的组织表达模式进行了分析,结果表明草鱼IL-34在各组织中呈差异性表达,其中以脾脏中的表达水平最高,其次是肠、头肾、胸腺、鳃、皮肤和大脑,而在肝脏中表达量最低。随后通过腹腔注射方法使草鱼感染柱状黄杆菌和呼肠孤(Grass carp reovirus,GCRV)病毒,qPCR检测结果显示,感染柱状黄杆菌12 h后,头肾中IL-34表达量上升,72 h后,脾脏中IL-34表达量上升。而在感染GCRV病毒3 d后的鳃中、7 d后的脾脏中IL-34的表达量均发生了显著性上升,表明IL-34可能在草鱼抵御病原微生物入侵的免疫反应中发挥重要作用。3.将去除信号肽的草鱼IL-34 CDS区核苷酸片段克隆到原核表达载体pEHISTEV,通过IPTG诱导成功表达了含有6个组氨酸的草鱼IL-34成熟肽融合蛋白,经过Superdex 75柱层析获得了纯化的IL-34蛋白。体外分离草鱼头肾原代巨噬细胞进行IL-34蛋白的生物学活性验证,同时,利用在HEK-293T细胞表达的草鱼IL-34重组蛋白,对原核表达的IL-34的功能进行了比较分析。结果表明IL-34可提高巨噬细胞中促炎症细胞因子IL-1β、IL-6和IL-8的表达,同时降低抑炎症细胞因子IL-10和TGF-β1的表达,表明IL-34能够增强炎症反应,可能是一种促炎症细胞因子。4.制作了草鱼IL-34多克隆抗体,并用Western blotting验证了抗体的特异性。对柱状黄杆菌感染3 d的草鱼进行了组化分析,对细菌感染后IL-34在体肾和肠组织中的表达进行了定量和定性验证,结果发现感染状态下IL-34的阳性区域主要集中在肾小管官腔,而肠中的阳性区域主要集中在肠的外表面。以上研究获悉了草鱼IL-34的分子信息和表达模式,对IL-34在草鱼免疫系统中发挥的生物学功能作出了表征,丰富了硬骨鱼中IL-34的研究,为阐明草鱼IL-34的免疫调控功能以及病害防控提供了重要的理论基础和潜在的应用前景。