论文部分内容阅读
目的：用表达外源性端粒酶催化亚基的人骨髓间充质干细胞建立永生化抗砷细胞模型,研究长期低剂量砷暴露的人骨髓间充质干细胞是否分化。
方法：用含有人端粒酶催化亚基(hTERT)基因的逆转录病毒质粒pBabepuro-hTERT感染人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)细胞,经嘌呤霉素(puro)筛选出转基因细胞,将其命名为hTERT-hBMSCs。应用RT-PCR检测hTERT在hTERT-hBMSCs细胞中的表达,端粒酶重复序列扩增(telomere repeatamplification protocol assay,TRAP)酶链免疫吸附试验(ELISA)法检测hBMSCs转染前后端粒酶活性的变化：用1μmol/L的亚砷酸钠诱导hTERT-hBMSCs产生抗砷性,并设立不加砷平行培养的hTERT-hBMSCs及同样的条件诱导hBMSCs产生抗砷性作为对照组；48小时急性砷毒性实验检测细胞生存率；X-gal染色法检测细胞衰老相关的β-半乳糖苷酶的表达；TRAP(PCR)-ELISA法检测砷诱导前后hTERT-hBMSCs端粒酶活性；免疫细胞化学及平板克隆形成实验分析抗砷细胞的生物学特性,RT-PCR及免疫细胞化学检测Oct-4在抗砷细胞中的表达；实时定量PCR检测ABC家族成员ABCG2在抗砷细胞中的表达。
结果：用逆转录病毒法将外源性hTERT基因转入hBMSCs后,hTERT-hBMSCs表达外源性的hTERT,且hTERT-hBMSCs端粒酶活性高于未转染组；1μmol/L亚砷酸钠诱导hTERT-hBMSCs 4周,48小时急性砷毒性实验检测hTERT-hBMSCs抗砷性尚未产生,细胞衰老特异性β-半乳糖苷酶的阳性表达率为86.3±3.90％,明显高于未诱导组(未见β-半乳糖苷酶阳性表达细胞),端粒酶活性明显下调：而1μmol/L的亚砷酸钠诱导hBMSCs12周后,细胞表现出了抗砷性,表面抗原CD29表达阳性,不具有肿瘤细胞的恶性增殖能力,Oct-4及ABCG2在抗砷细胞中的表达低于未用砷诱导的hBMSCs。
结论：砷能下调hTERT-hBMSCs端粒酶活性,不能建立稳定表达外源性hTERT的永生化抗砷细胞株：长期低剂量的砷可以诱导hBMSCs分化。