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miRNAs是一类内源性非编码转录后调控的小RNA,通过作用于靶基因m RNA的非编码区抑制靶基因翻译或引起其降解,从而参与基因表达调控;在机体的发育、增殖、分化、凋亡等生物学过程中起重要作用。目前研究人员已经鉴定了多个物种中存在大量miRNAs,且已有研究表明miRNAs的种子序列与其靶基因3’UTR上的靶标位点特异性识别,进而调控黑色素细胞的生成来影响动物毛色的发生。课题组在前期研究基础上发现,miR-202在浅毛色动物皮肤中的表达量显著高于深毛色动物。靶基因预测发现一些靶基因为显性白毛调控基因;其中,kit基因是控制白毛色的主要候选基因,但miR-202是如何调控这些靶基因从而调控动物毛色形成的?其是否影响黑色素细胞的生成?目前未见相关报道。因此,本研究以不同毛色小鼠皮肤组织为研究对象,利用生物信息学软件预测miR-202与毛色相关的靶基因。同时通过q PCR和Western blot等方法从m RNA水平、蛋白水平进一步明确miR-202及其靶基因在不同毛色小鼠皮肤中相对表达量的关系;再通过构建双荧光素酶报告基因载体与miR-202模拟物共转染到HEK293T细胞中,鉴定miR-202与kit等3’UTR的结合情况;利用RNAi实验将si RNA对靶基因的沉默效果与miR-202对靶基因的抑制效果进行比较,从生物表型确认其靶点;阐明miR-202参与小鼠毛色形成的分子机制,为今后人工调控或改良动物毛色提供重要的理论依据和研究平台。具体研究结果如下:1.miR-202荧光定量结果显示:miR-202在C57BL/6小鼠和BALB/c小鼠皮肤中均有表达,且在C57BL/6小鼠皮肤中的表达量显著高于BALB/c小鼠(P<0.05)。由此推断,miR-202参与小鼠毛色的调控。2.通过Target Scan、miRWalk2.0、micro RNA.org等软件预测以及查阅相关文献,最终确定miR-202与毛色遗传相关的靶基因为wnt5a、kit、tcf7。3.靶基因荧光定量和Western blot检测结果显示:wnt5a、kit、tcf7在BALB/c小鼠皮肤中的表达量较C57BL/6小鼠高(P<0.05),Western blot检测结果与荧光定量检测结果趋势一致。4.免疫组化结果显示,wnt5a、kit、tcf7在C57BL/6小鼠和BALB/c小鼠的表皮(基底层)和真皮(皮脂腺和毛囊)中均有不同程度的表达。其中,wnt5a、kit在C57BL/6小鼠的皮脂腺和基底层表达量较高,而kit和tcf7在C57BL/6小鼠的毛囊中呈低表达;此外,kit在BALB/c小鼠的皮脂腺和基底层的表达量较高,而wnt5a和tcf7在BALB/c小鼠的基底层中几乎不表达。5.双荧光素酶报告基因检测miR-202和wnt5a、kit、tcf7的靶标位点,确定miR-202与这三个靶基因存在靶向作用。6.过表达miR-202,荧光定量检测结果显示,miR-202在过表达组的表达量高于阴性对照组,而靶基因的表达趋势与之相反(P<0.05),但miR-202及其靶基因在过表达组和阴性对照组的表达量均低于正常组。7.过表达miR-202,Western blot检测结果显示,wnt5a、kit、tcf7在过表达组的表达量显著低于阴性对照组(P<0.05),其在阴性对照组的表达量与正常组无显著差异。以上结论表明,wnt5a、kit和tcf7是miR-202的靶基因,且miR-202通过负调控这几个靶基因参与小鼠毛色的生成。