表观遗传沉默机制在植物基因表达调控,生长发育以及胁迫应答中具有重要的作用。与此同时,植物中也存在一些抗沉默因子,它们通过DNA去甲基化,组蛋白修饰和染色质重塑等途径来抑制基因的表观遗传沉默。为研究植物抗基因沉默的机制,本研究以模式植物拟南芥为材料,采用一套基于荧光素酶（LUC）的报告基因系统,筛选拟南芥抑制基因沉默的重要因子。在这套筛选系统中,报告基因LUC的启动子为双35S启动子（d35S）,在同一个载体中还含有一个相同启动子启动的NPTII基因,报告基因被转入到拟南芥rdr6-11（RNA-dependent RNA polymerase 6-11）突变体中。利用这套遗传筛选系统,本研究通过正向遗传学的方法筛选到一个突变体（命名为P31）。在P31突变体中,报告基因LUC和NPTII均发生了基因沉默,因此认为控制该性状的突变基因具有抑制基因沉默的功能。本研究以这个P31突变体为研究对象,对其突变基因的抗沉默机制进行了深入研究,获得了以下结果:1.发现控制报告基因沉默表型的突变基因是SAC3B（At3g06290）。通过图位克隆将突变基因锁定在3号染色体1800K至2087K的区间,对突变体进行了全基因组测序分析,发现mRNA转运复合体TREX-2的核心组分SAC3B基因（At3g06290）编码区发生了 C（1321）到T的突变,并引发对应氨基酸序列从谷氨酰胺突变为一个提前的终止密码子。在突变体中转入野生型SAC3B基因后,恢复了报告基因LUC和NPTII的表达,表明SAC3B确实是控制报告基因沉默的关键基因。2.发现拟南芥SAC3B突变不仅导致了报告基因沉默,还导致了一系列生长发育缺陷,包括根长变短,叶片卷曲,株高变矮等。另一个SAC3B的T-DNA插入突变体sac3b-4也出现类似的生长发育缺陷。在P31突变体中转入野生型SAC3B基因后,发育表型得到了恢复,说明SAC3B的确是控制这些生长发育缺陷的关键基因。3.发现SAC3B突变导致了报告基因启动子区的表观遗传修饰改变和转录受阻。DNA甲基化抑制剂5-Aza-dC处理恢复了 P31突变体中报告基因LUC的表达。甲基化测序表明d35S启动子区反向链甲基化水平升高。染色质免疫共沉淀实验结果显示d35S启动子区组蛋白H3K9二甲基化水平升高,而RNA聚合酶PolⅡ在LUC和NPTII启动子区富集量下降,说明SAC3B突变导致了基因的表观遗传沉默。4.发现SAC3B突变并没有引起基因组水平甲基化的升高,相反却导致基因组中CHG和CHH甲基化水平略微降低。通过对P31突变体和野生型进行全基因组甲基化测序分析,发现P31突变体中甲基化水平显著升高的位点只有298个,而甲基化水平显著降低的位点有425个,其中大部分在转座子原件区（TE）。因此认为SAC3B不直接参与DNA的去甲基化。5.发现不仅SAC3B突变能够导致基因沉默,其它的mRNA转运因子如THP1和NUP1突变也能导致报告基因沉默。将mRNA转运复合体TREX-2的另外一个组分的突变体thp1-1通过杂交的方法引入报告基因系统,发现thp1-1也能导致报告基因LUC和NPTII的沉默。同样将核孔蛋白突变体nup1-1引入报告基因系统,也出现报告基因沉默的现象。因此认为mRNA转运因子可能通过某种特定的途径抑制报告基因沉默。6.揭示了 R-loop积累和稳定可能是造成基因沉默的原因。通过R-loop步移实验,证明d35S启动子区存在R-loop的积累;利用特异性识别DNA:RNA杂合二聚体结构的S9.6单克隆抗体进行DNA IP实验,发现P31突变体中R-loop的稳定性比野生型增强了大约3倍,表明SAC3B突变造成了 R-loop的积累和稳定。7.提出了SAC3B突变导致基因沉默的一种机制模型:SAC3突变致使mRNA出核转运和转录解偶联,由此引发报告基因启动子区R-loop积累和稳定。稳定的R-loop结构一方面作为“路障”直接阻碍RNA聚合酶Pol II的转录延伸,另一方面,R-loop结构中滞留的非编码RNA可能通过招募siRNA促进启动子区DNA甲基化和异染色质形成,从而导致基因的表观遗传沉默。综上所述,本研究首次发现植物mRNA转运因子突变能够造成基因的表观遗传沉默,并发现SAC3B突变导致了报告基因启动区R-loop结构的积累和稳定,提出R-loop积累是造成基因沉默的原因。因此,本研究揭示了拟南芥mRNA转运因子在抑制基因表观遗传沉默中的作用,为进一步理解基因的表观遗传沉默和抗沉默机制提供了新的科学依据。