白色念珠菌是一种临床常见的条件性致病菌,易存在于正常人口腔、呼吸道、肠道及阴道等,为常见念珠菌病的主要致病菌。白色念珠菌是二倍体,没有性周期,能够从单细胞芽酵母到丝状的形态转变,广泛的丝状生长导致菌丝的形成,即出芽方式繁殖。白色念珠菌生长繁殖所需的能量由白色念珠菌的线粒体提供。琥珀酸脱氢酶（Succinic dehydrogenase,SDH）是线粒体内的一种酶,参与线粒体内供应能量的三羧酸循环,在白色念珠菌能量供应方面起重要作用;Ca²⁺-Mg²⁺ATPase是一种维持线粒体正常生理功能的酶,主要对维持其内环境中Ca²⁺和Mg²⁺浓度稳定起着极其重要的作用。因此,SDH、Ca²⁺-Mg²⁺ATPase在维持白色念珠菌生长繁殖方面有着不可或缺的作用。随着各种免疫抑制剂以及抗真菌药的广泛应用,导致念珠菌病感染逐渐增多且念珠菌耐药现象日趋严重,亟需研究开发其他替代抗真菌靶点的新型抗真菌药物。鞣质,又称为单宁,是一种结构复杂的水溶性多元酚类化合物,而柿果中含丰富的缩合鞣质。鞣质能凝固微生物体内的原生质,故有较强抑菌作用。本实验初步探讨柿鞣质水提液对白色念珠菌线粒体内SDH、Ca²⁺-Mg²⁺ATPase酶活力的影响机制,了解柿鞣质水提液抑菌作用,对鞣质类化合物在口腔临床应用提供理论依据。第一部分白色念珠菌线粒体蛋白的提取与测定目的:通过Lowry法测定白色念珠菌线粒体蛋白含量,探索白色念珠菌不同破壁方式及最优条件。方法:采用反复冻融-超声破壁法以及反复冻融-快速研磨仪破壁法两种不同破壁方式,通过Lowry法来测定不同条件下破壁方式的线粒体蛋白质含量。通过正交试验法筛选反复冻融-超声破壁法的最优条件。结果:1. 标准蛋白溶液在0-100μg/m L范围内呈良好的线性关系,标准曲线回归方程为y=0.0018x-0.0056,相关系数为R²=0.9994。2.反复冻融-超声破壁法:影响因素工作总时间（A）、超声功率（B）、工作时间（C）对蛋白质含量影响为:C>A>B。最佳测定条件为:A₁B₂C₂,即-20℃下反复冻融并结合超声破碎破壁,即工作总时间为5 min,功率为50%,工作时间为5 s。由方差分析可知,工作时间对白色念珠菌线粒体蛋白含量影响最为显著（P<0.01）。3.反复冻融-快速研磨仪破壁法:快速研磨仪破壁法不同作用时间、不同转速下测定白色念珠菌蛋白含量有显著性差异（P<0.05）,最优条件为工作时间为2.0 min,转速为1600 rpm。各时间组3.0 min组与4.0 min组之间线粒体蛋白含量差异无统计学意义（P>0.05）。各转速组之间线粒体蛋白含量差异无统计学意义（P>0.05）。4.两种不同破壁方法最优选择:反复冻融-超声破壁法与反复冻融-快速研磨仪破壁法测定白色念珠菌蛋白含量有显著性差异（P<0.05）。第二部分柿鞣质水提取液对白色念珠菌抑菌机制研究目的:检测不同浓度柿鞣质水提取液作用白色念珠菌后,琥珀酸脱氢酶（SDH）、Ca²⁺-Mg²⁺ATPase酶活力变化,探索柿鞣质水提取液抗真菌机制。方法:采用微量稀释法测定柿鞣质水提取液对白色念珠菌的最小抑菌浓度（MIC）;检测白色念珠菌经柿鞣质水提取液作用后SDH、C-a²⁺-Mg²⁺ATPase活力的变化;柿鞣质水提取液浓度为0μg/m L、61μg/m L、122μg/m L、244μg/m L,分别作用白色念珠菌48 h后,收集白色念珠菌,制备菌悬液,破壁,利用差速离心,提取白色念珠菌线粒体悬液作为样品溶液;采用Lowry法检测线粒体蛋白质含量;根据样品溶液中酶的不同分别加入相应试剂,用分光光度计分别于650 nm、636 nm处记录吸光度（OD）值,以此计算SDH酶以及Ca²⁺-Mg²⁺ATPase酶活力。结果:1.没食子酸标准品溶液的标准曲线,以吸光度A为纵坐标,浓度C作线性回归方程,线性回归方程为y=46.121x+0.0003,相关系数为R2=0.9998,表明标准品溶液在0.001-0.01 mg?m L之间呈良好的线性关系,2. 柿鞣质水提取液对白色念珠菌的MIC值为77μg/m L。3. 柿鞣质水提取液空白组0μg/m L的琥珀酸脱氢酶活力与61μg/m L浓度组差别不大（P>0.05）,差异无统计学意义,但显著高于浓度组122μg/m L、244μg/m L,差异有统计学意义（P<0.05）,且出现柿鞣质水提取液浓度越高SDH活力越低的趋势,随着柿鞣质水提取液中鞣质浓度的增加,SDH的活力不断下降。4. 白色念珠菌经柿鞣质水提取液浓度作用后Ca²⁺-Mg²⁺ATPase酶活力变化:柿鞣质水提取液浓度为61μg/m L与空白组0μg/m L之间差异不具有统计学意义（P>0.05）;122μg/m L、244μg/m L浓度组Ca²⁺-Mg²⁺ATPase活力明显低于空白组0μg/m L,差异有统计学意义（P<0.05）,且呈现出柿鞣质水提取液浓度越高,Ca²⁺-Mg²⁺ATPase酶活力越低的趋势;各组之间两两比较Ca²⁺-Mg²⁺ATPase活力差异具有统计学意义（P<0.05）。结论:1.反复冻融-超声破壁法进行白色念珠菌破壁能较好的获取白色念珠菌线粒体蛋白。2.柿鞣质水提取液可降低白色念珠菌SDH酶、Ca²⁺-Mg²⁺ATPase酶活力。3.柿鞣质水提取液对白色念珠菌有抑制作用。