上世纪90年代以来，国内外学者相继发现在DCM等心脏疾病患者血清中存在有β肾上腺素受体(β1和β2AR)的自身抗体，这些自身抗体可通过作用于相应受体细胞外第二环而产生类激动剂样效应，且采用相应细胞外第二环肽段长期免疫动物，可使其心脏功能及形态均发生类似DCM病人的变化。2005年，我们以人工合成的人β3AR细胞外第二环的肽段作为抗原，采用酶联免疫吸附实验(ELISA)筛查了217例心衰病人和100例正常人血清中的抗β3AR抗体。结果发现：心衰患者血清中抗β3AR抗体的阳性率明显高于正常人(27％vs11％，P＜0.05)。研究还发现：该抗体具有类β3AR激动剂的负性变时、变力效应，且此效应具有不脱敏现象。但是，上述实验结果还不足以说明针对β3AR细胞外第二环的自身抗体与心衰发病的关系。 本课题进行以下三方面的研究：1.不同原发疾病所致心衰患者血清中，β3AR自身抗体分布的免疫学特征及其与心衰某些特异性指征的相关性分析，借以分析β3AR自身抗体在不同原发疾病心衰发生中的可能作用。2.在β3AR自身抗体阴性的大鼠，建立增大心脏压力后负荷致心衰的动物模型，观察在心衰的发生过程中是否会产生β3AR的自身抗体，如果产生，其产生规律为何。3.通过用β3AR细胞外环肽段主动免疫正常大鼠，观察在β3AR自身抗体长期存在下，心脏结构和功能是否会发生改变。 一、心力衰竭患者血清中β3AR自身抗体的种类和可能的临床意义 目的：本研究分别以合成的人β3AR细胞外第一环、第二环和第三环表位肽段作为抗原，应用酶联免疫吸附测定(ELISA)技术，检测不同原发疾病所致心衰患者血清中β3AR的自身抗体，并分析抗β3AR自身抗体的免疫反应性及其对心脏功能活动的影响，以探讨心衰患者血清中抗β3AR自身抗体存在的病理生理意义。 方法：1.研究对象及标本166例继发于扩张型心肌病(简称扩心病，n=30)、冠状动脉粥样硬化性心脏病(简称冠心病，n=93)、高血压性心脏病(简称高心病，n=33)和风湿性心脏病(简称风心病，n=10)的心衰患者。全部患者除外内分泌、自身免疫性疾病、各种感染性疾病和免疫缺陷性疾病，采集血样前3d避免服用免疫抑制剂和βAR阻滞剂。入选者均于空腹12h后采集静脉血液并及时分离血清置于-20℃保存。2.肽段合成：3个抗原肽段均由西安美联生物工程公司合成，相当于人β3AR细胞外第一环、第二环及第三环氨基酸序列的特异性抗原决定簇，合成肽段纯度为95％。人β3AR氨基酸序列检索来自NCBI(AC:P13945，GI:461604)(见表2)。合成的肽段储存于-20℃备用。3.检测方法：应用SA-ELISA检测方法。4.判断标准；抗体水平以标本1:20稀释时测定的OD值反映。5.统计学处理：采用SPSS13.0统计软件对实验数据进行统计。 结果：1.正常人和心衰患者血清中β3AR自身抗体的种类及阳性率经ELISA筛选发现，心衰患者及正常人血清中均存在分别针对β3AR细胞外第一环、第二环和第三环的自身抗体(依次表示为anti-β3-ECⅠ，anti-β3-ECⅡ和anti-β3-ECm)，但各自阳性率不同。这一结果提示β3AR自身抗体(主要为anti-β3-ECⅡ抗体)可能与扩心病及冠心病所致心衰的发病过程有关。2.正常人和心衰患者β3AR自身抗体的水平分析结果提示，anti-β3-ECⅡ是与心衰(尤其是扩心病所致心衰)发病过程有关的主要的β3AR自身抗体的种类。3.分析在不同原发疾病所致心衰中各类β3AR自身抗体(anti-β3-ECⅠ，anti-β3-ECⅡ和anti-β3-ECⅢ)对心功能的影响。结果提示：β3AR自身抗体(主要是anti-β3-ECⅡ)与扩心病及冠心病所致的心衰有关，心衰发病过程中，anti-β3-ECⅡ可能对由β1AR自身抗体诱发的心脏功能障碍和心肌损伤中起着心肌保护的作用。 结论：1.针对β3AR细胞外第二环的自身抗体，在扩心病和冠心病所致心衰患者中的阳性率和/或抗体水平均明显高于正常人，提示它可能与心衰的发病过程有关。2.针对β3AR细胞外第一环的自身抗体，在扩心病患者中也有较高的阳性率，但抗体水平较低；针对β3AR细胞外第三环的自身抗体则与心衰发病无关。3.心衰发病过程中，anti-β3-ECⅡ可能对由β1AR自身抗体诱发的心脏功能障碍和心肌损伤起着一定的心肌保护作用。 二、心衰的发生发展过程与β3AR自身抗体产生的关系 目的：为进一步探讨β3AR自身抗体与心衰发病的关系，在β3AR自身抗体阴性的大鼠身上制备了增大心脏压力后负荷的心衰模型，借以观察在心衰发生发展过程中，β3AR自身抗体的产生规律，并分析β3AR自身抗体的产生与心肌β3AR密度及免疫系统机能变化的联系，以便查明β3AR自身抗体在心衰发生发展过程中所起的作用。 方法：1.采用缩窄腹主动脉法制备心衰大鼠模型。2.大鼠血清中β3AR自身抗体的测定。3.大鼠在体心功能测定，同时按无菌操作法分离大鼠脾脏。4.心脏组织形态学检测，并利用图象分析技术进行心肌染色切片胶原容积百分比(CVF)的测定。5.蛋白免疫印迹技术(WesternBlot)测定心肌细胞β3AR含量，采用化学发光法测定。6.大鼠B淋巴细胞含量测定，并分析流式结果。7.B淋巴细胞抗体生成能力测定。 结果：实验结果提示，在心衰发生发展过程中β3AR自身抗体具有逐渐产生、缓慢增高、维持、自然消退的变化规律。心衰模型形成过程中，心肌细胞β3AR的含量有所改变，但实验还无法分析β3AR上调和β3AR自身抗体产生之间是否有因果关系。结果提示，β3AR自身抗体的产生可能与心衰发生发展过程中机体免疫系统功能的改变具有内在联系。 结论：1.在建立压力后负荷型大鼠心衰模型的过程中，原为β3AR自身抗体阴性的大鼠血清中开始出现高水平的β3AR自身抗体，但该抗体具有一定的产生、维持和减退的自我消长的时间过程。2.β3AR的产生过程与脾淋巴细胞抗体生成能力的改变趋势一致，但与B淋巴细胞数量无关。3.β3AR自身抗体水平出现峰值的时间与大鼠心肌细胞膜受体β3AR的上调时间一致，说明二者在功能作用上有一致性。4.本实验证实在心衰的发生发展过程中，心脏的病理生理改变促进了β3AR自身抗体的产生，但其启动β3AR自身抗体产生的确切机制还有待进一步探讨。 三、β3AR自身抗体长期存在对在体大鼠心脏结构及功能的影响 目的：采用β3AR细胞外第二环的合成肽段主动免疫正常大鼠六个月，观察被免疫大鼠在β3AR自身抗体的持续刺激下心脏结构及功能的改变，并探讨β3AR自身抗体可能的信号转导通路，借以分析β3AR自身抗体在心衰发病过程中可能的作用机制。 方法：对血清中β3AR自身抗体的测定。大鼠在体心功能测定。心肌形态学指标的测定：采用光学显微镜及电子显微镜技术测定。采用WesternBlot技术，进行心肌组织β3A-R、eNOScAMP、cGMP、NO(NOx)含量的检测。 结果：1.对照组大鼠血清中β3AR自身抗体水平始终无明显改变(P＞0.05)。(见图11)提示主动免疫模型制备成功。2.主动免疫过程中大鼠心功能的变化：提示β3AR自身抗体的持续作用并未造成实验大鼠心功能的明显改变，但有改善心功能的倾向。3.主动免疫过程中大鼠心肌形态学改变特点：提示在主动免疫6个月的情况下，β3AR自身抗体的持续作用并未造成实验大鼠心肌结构发生明显改变。这提示需要进一步延长免疫时间或建立被动免疫心衰模型大鼠，以便最终确定β3AR自身抗体在心衰发生发展过程中的作用机制。4.主动免疫过程中大鼠心肌组织各个含量的测定。 结论：1.在不同原发疾病所致心衰患者及正常人血清中均存在有分别针对β3AR细胞外第一环、第二环和第三环的自身抗体，但其中以针对β3AR细胞外第二环的自身抗体(anti-β3-ECⅡ)出现的阳性率和抗体水平为最高(显著高于一、三环的自身抗体)，且在心衰病人显著高于正常人，提示anti-β3-ECⅡ是重要的功能性抗体，参与了心衰(主要是扩心病和冠心病所致心衰)的病理生理过程，可能对由β1AR自身抗体诱发的心脏功能障碍和心肌损伤起着心肌保护的作用。2.心衰大鼠模型在心衰发生发展过程中产生了β3AR自身抗体，且该抗体具有一定的产生、维持和减退的自然消长过程；β3AR自身抗体的产生过程与脾淋巴细胞抗体生成能力增高的趋势一致，而与B淋巴细胞数量无关；伴随β3AR自身抗体的增高，心肌组织β3AR的数目也有上调，说明二者在功能上的一致性，高度提示其在心衰中具有一定的作用。3.在主动免疫6个月条件下，β3AR自身抗体对在体大鼠的持续作用未能引发心脏结构和功能的明显改变，但有改善心功能的倾向；此外，β3AR抗体长期存在，可以使大鼠心肌组织中eNOS-NO-cGMP信号转导途径活跃，提示β3AR自身抗体可能通过该途径发挥其病理生理作用。