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目的:构建并鉴定Nodal基因的RNAi慢病毒表达载体,转染人胃腺癌癌细胞MNK-45,沉默人胃腺癌癌细胞MNK-45中Nodal,探讨Nodal基因对人胃腺癌癌细胞MNK-45凋亡及血管生成的影响。方法:1)针对Nodal mRNA设计合成3条siRNA,及设计1条阴性对照siRNA。退火形成双链DNA,与荧光载体(GV248)连接,对构建的3个重组质粒进行DNA测序,如测定序列与目的序列一致,提示插入Nodal基因RNAi序列正确。2)对重组慢病毒载体进行包装及鉴定,对测序正确的菌液进行质粒抽提并与3种质粒载体(重组质粒及pHelper1.0、pHelper2.0)共转染293T细胞,转染293T细胞后96h,荧光显微镜观察细胞,测定病毒滴度。3)将慢病毒感染人胃腺癌细胞MNK-45。感染72h后,进行荧光倒置显微镜观察感染效率。qPCR检测Nodal基因的表达。4)shRNA慢病毒感染MKN-45细胞,培养5天后,使用eBioscience的凋亡检测试剂盒及流氏细胞仪检测细胞凋亡情况。5)采用人脐静脉内皮细胞(HUVECs)三维培养法分析慢病毒感染MKN-45细胞培养上清对血管形成的影响。Cellomics仪观察人脐静脉内皮细胞(HUVECs)血管面积、平均血管长度、平均血管宽度、血管节点数来评估血管生成情况。结果:(1)重组慢病毒载体的测序:对构建的3个重组质粒进行DNA测序,测序结果显示,测定序列与目的序列一致。提示插入Nodal基因RNAi序列正确。(2)重组慢病毒载体的包装及鉴定:将3种质粒载体转染293T细胞后96h,荧光显微镜观察细胞,见细胞生长良好,荧光强烈。测定病毒滴度为5×108TU/ml。(3)qPCR检测RNA干扰后Nodal基因的表达:RNAi慢病毒感染后,MKN-45细胞Nodal基因的表达水平显著下调。LV-NODAL-RNAi(44787-1)感染、LV-NODAL-RNAi(44789-1)感染分别下调了80.3%和84.9%。(4)RNA干扰Nodal基因对MKN-45细胞凋亡的影响:shRNA慢病毒感染MKN-45细胞,培养5天后,干扰组凋亡率与对照组比较明显升高(P<0.05)。(5)对体外HUVEC细胞血管生成的影响:96孔板中铺Matrigel,用收集的目的细胞培养上清液重悬HUVEC细胞,铺96孔板。培养后加入Calcein AM,室温孵育。与对照组比较,实验组血管生成主要相关参数中,血管面积、平均血管长度、平均血管宽度、血管节点数无显著性差异(P>0.05)。结论:本研究成功构建了人Nodal基因的RNAi慢病毒表达系统。通过RNAi技术有效的抑制了人胃癌细胞MNK-45细胞Nodal基因的表达,并且发现Nodal基因干扰后显著增加胃癌细胞凋亡的数量,但对血管形成影响不明显。