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羊毛品质主要由羊毛纤维的特性决定,羊毛纤维由角质层、皮质和髓质组成,其中皮质部表达的基因对羊毛纤维的性状有重要影响,KAP13-1基因在绵羊毛囊皮质部表达,且影响毛纤维的细度。本课题组在前期研究中构建了具有在毛囊皮质部特异表达的绵羊KAP11-1启动子并制备了毛囊皮质部特异表达绵羊KAP13-1和绿荧光蛋白ZSG的转基因小鼠,命名为pKAP11-1-sKAP13-1-2A-ZSG-Plus(简称Plus小鼠),初步鉴定发现Plus小鼠的毛纤维细度与野生型相比变细了。本研究在此基础上对Plus小鼠进行了三个世代(G2-G4代)的传代交配,首先分析Plus小鼠外源基因遗传和表达的稳定性,并对Plus小鼠毛囊表型进行检测,最后通过生物信息学预测、EMSA、免疫荧光等技术鉴定能够与KAP11-1启动子结合的转录因子,并在不同的绵羊群体中对转录因子NFAT5进行了SNP筛选。主要的研究结果如下:1、Plus小鼠外源基因表达的稳定性检测(1)利用基因组步移技术鉴定发现Plus小鼠外源基因插入在小鼠17号染色体Ermard基因和delta-like protein 1 precursor基因之间的基因间区内,以及X染色体上的Mbnl3基因和Hs6st2基因之间的基因间区内。在三个世代的Plus小鼠的9个个体中检验插入位点,发现Plus小鼠的插入位点没有随着配种传代而改变。(2)在G2、G3和G4世代Plus小鼠基因组中检测外源基因的拷贝数,结果表明在G2代Plus小鼠中外源基因有~6个拷贝,G3代Plus小鼠有~4个拷贝,G4代有~2个拷贝,说明随着传代的进行外源基因的拷贝数逐渐趋于稳定。(3)检测了G2、G3和G4世代Plus小鼠外源基因的表达量变化,发现外源基因的表达量与外源基因的拷贝数成正相关,并且G4世代Plus小鼠的毛发仍可观察到绿荧光。2、Plus小鼠毛囊表型的测量分析测定了以下几种毛囊表型(1)初级毛囊直径、初级毛囊毛乳头面积和初级毛囊毛干直径;(2)次级毛囊直径和次级毛囊毛干直径;(3)毛囊密度;(4)毛囊髓质部空气间隙密度。其中初级毛囊毛乳头面积和毛囊髓质部空气间隙密度在Plus小鼠和野生型小鼠中没有显著差异,但是(1)雌性野生型小鼠的初级毛囊直径显著大于雌性Plus小鼠的初级毛囊直径(P=0.0377);(2)野生型小鼠的次级毛囊直径显著大于Plus小鼠的次级毛囊直径(雄性:P=0.0139,雌性:P=0.0109);(3)雌性野生型小鼠的毛囊密度显著低于雌性Plus小鼠的毛囊密度(P=0.0078)。以上结果说明sKAP13-1在Plus小鼠中能够影响Plus小鼠的毛囊表型,sKAP13-1可能在毛囊发育过程中起重要作用。3、对KAP11-1启动子有调控作用的转录因子研究预测发现转录因子NFAT5和KLF4可能与KAP11-1上游-251~-148bp区域结合,EMSA结果表明NFAT5能够与KAP11-1上游-251~-148bp区域上的结合位点结合,但没有验证KLF4与该区域互作。NFAT5免疫荧光结果显示该转录因子在Plus小鼠的皮质部有表达并且在生长期(P9天、P15天)的毛囊中有较强的表达,在休止期(P18)和退行期(P21)的毛囊中基本不表达,这与绵羊KAP11-1在毛囊中的表达模式以及Plus小鼠中sKAP13-1的表达模式一致。结果说明NFAT5可能在KAP11-1的表达调控中起作用。4、转录因子NFAT5基因的SNP在不同绵羊群体中的多态性检测通过数据库预测发现绵羊NFAT5基因上有30个可能改变氨基酸的SNP位点,通过PCR测序检测了其中24个SNP位点,发现只有3个SNP位点在中国美利奴羊(新疆型)、德国美利奴羊以及西藏羊群体中存在多态性。卡方独立性检验发现这3个SNP位点的等位基因频率在这3个绵羊群体中差异不显著。