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胃癌在我国发病率高,是严重威胁人民健康和生活质量的恶性肿瘤。目前对于胃癌发生、发展及侵袭、转移的分子机制并不十分清楚,影响了胃癌治疗的效果以及治疗方法的改进与发展。Rho蛋白家族是GTP蛋白酶Ras超家族中的一部分,对细胞许多的生理生化过程,如细胞增殖、转化、迁移以及形态等起着重要的调控作用。大多数Rho蛋白都有两种存在形式:与GTP结合的活性形式及与GDP结合的非活性形式。RhoE/ Rnd3是Rho蛋白家族的亚家族(Rnd蛋白家族)的成员之一,RhoE虽然可以结合GTP,却并没有GTP酶活性,不能水解GTP,因此在体内只存在与GTP结合形式。这种特性赋予RhoE许多不同于Rho家族蛋白的功能,例如抑制肌动蛋白细胞骨架形成,阻滞细胞周期进展,抑制多种因素诱发的细胞凋亡,增强细胞的运动能力以及调控细胞的形态变化。在肿瘤中因其在某些肿瘤中表达上调(例如胰腺癌、黑素瘤和非小细胞肺癌)而在某些肿瘤中表达下调(例如前列腺癌),RhoE可作为肿瘤诊断或预测预后的分子。研究证明,RhoE蛋白通过调控多种组织细胞内肌动蛋白细胞骨架的形成能够促进细胞的迁移能力以及肿瘤细胞的侵袭能力。我实验室前期的研究发现:RhoE能够通过抑制BAX促进胃癌多药耐药,但该分子对于胃癌其他恶性表型有无作用尚未见报道,我们前期利用Western blot的方法检测RhoE在胃癌组织中的表达情况,结果显示:发生转移的胃癌组织原发灶中RhoE蛋白表达水平显著高于未发生转移的胃癌组织原发灶,提示RhoE可能在胃癌的转移中发挥重要作用,RhoE参与胃癌侵袭与转移的具体作用和机制尚有待进一步研究。目的:1.检测RhoE蛋白在发生转移的胃癌组织原发灶及无转移的胃癌组织原发灶中的表达情况以及检测RhoE在蛋白水平和mRNA水平在转移潜能不同的胃癌细胞系中的表达情况。在蛋白水平和mRNA水平研究RhoE与胃癌侵袭和转移的关系。2.设计并构建RhoE的正义载体,应用瞬时和稳定转染技术探讨增加细胞内的RhoE表达对胃癌细胞体外迁移,侵袭能力和体内转移能力的改变,为进一步揭示RhoE蛋白在胃癌转移中的作用机理提供理论依据。3.初步探讨RhoE作用于胃癌转移的下游分子机制。方法:1.利用免疫组织化学和Western blot方法检测RhoE在正常胃组织,发生转移的胃癌组织原发灶,未发生转移的胃癌组织原发灶以及转移淋巴结中的表达。2.利用Western blot方法分别检测RhoE在蛋白水平上在转移潜能不同的胃癌SGC7901-M和SGC7901-NM中的表达。3.利用半定量PCR和qRT-PCR方法检测RhoE在mRNA水平上在转移潜能不同的胃癌SGC7901-M和SGC7901-NM中的表达。4.设计和构建RhoE正义表达载体,将构建正确的编码RhoE的质粒和空载体分别通过瞬时转染和稳定转染转入胃癌细胞SGC7901。5.利用Western blot鉴定瞬时转染和稳定转染的转染效果。6.损伤刮擦实验分析转染细胞体外迁移能力的改变。7.TRANSWELL侵袭实验分析转染细胞体外侵袭能力的改变。8.裸鼠尾静脉体内转移实验观察转染细胞及其对照细胞的体内转移能力差异。9.Western blot方法检测转染RhoE正义载体及对照的胃癌细胞系中MMP分子的蛋白表达。结果:1.免疫组织化学结果显示:正常胃组织中RhoE的阳性表达率较高,为73.5%,在胃癌组织中仅为23.5%,与正常胃组织相比表达水平也显著下降(p<0.05);RhoE在发生转移的胃癌原发灶中的阳性表达率为41.2%,显著高于其在未发生转移的胃癌原发灶中的阳性表达率5.9%(p<0.05);RhoE在发生转移的胃癌原发灶中的表达水平也显著高于未发生转移的胃癌原发灶(p<0.05);RhoE在胃癌原发灶中的表达水平与在转移淋巴结中的表达水平则无显著差异;RhoE主要定位于正常胃组织细胞和胃癌细胞的细胞浆。2.Western blot的结果显示:在12例发生转移的胃癌组织原发灶标本中可检测到RhoE的过表达(8/12,66.7%),而12例未发生转移的胃癌组织原发灶标本中仅有1例检测到RhoE表达(1/12,8.3%),与免疫组化结果一致。3.Western blot,半定量PCR和qRT-PCR方法对转移潜能不同的胃癌细胞系的检测结果显示:在蛋白水平和mRNA水平上,RhoE在转移潜能高的胃癌SGC7901-M细胞系中表达较强,在转移潜能低的胃癌SGC7901-NM细胞系中表达较弱(p<0.05)。4.胃癌SGC7901细胞瞬时转染和稳定转染RhoE正义表达载体后,Western blot结果显示RhoE表达明显上调。5.利用RhoE正义表达载体转染上调胃癌细胞SGC7901中RhoE的表达,可增强细胞的体外迁移和侵袭能力(p<0.05)。6.裸鼠尾静脉注射转移实验结果显示,转染了RhoE正义表达载体的胃癌SGC7901细胞注入裸鼠体内后与对照组相比,肿瘤在肺脏的转移发生率明显升高(p<0.05)。7.Western blot检测显示,利用RhoE正义表达载体转染胃癌SGC7901细胞后,细胞中的基质金属蛋白酶分子MMP9水平明显升高,而MMP2的表达水平则无明显变化。结论:1.与正常胃组织相比,RhoE在胃癌组织中的表达水平下降;而与未发生转移的胃癌组织原发灶相比,RhoE在发生转移的胃癌组织原发灶中表达水平明显增强,同时,RhoE在转移潜能高的胃癌细胞系中的表达水平明显高于转移潜能低的胃癌细胞系。2.利用RhoE正义表达载体转染胃癌细胞后,细胞的体外迁移,侵袭能力和体内转移能力均显著增强。3.RhoE可能通过(或部分通过)上调基质金属蛋白酶分子MMP9参与调节胃癌细胞的侵袭和转移,但胃癌的转移过程复杂且涉及多种分子和信号通路,其详细机制尚有待进一步探讨。综上,我们认为RhoE可能在胃癌转移过程中发挥重要作用,阐明胃癌转移过程的分子机制提供了一定的理论依据,同时为胃癌的临床治疗提供了新的思路和方法。