天祝白牦牛(Bos grunniens)是我国特有的牦牛品种,是当地牧民主要的生产生活资料,但由于该品种原始,繁殖力低下,自然繁育为2年1胎或3年2胎,严重制约着白牦牛的生产能力。睾丸作为主要的生殖器官,影响着雄性动物的繁殖性能,其主要功能是分泌激素、产生精子等,这些生理过程需要多种蛋白质精确表达和调控。因此,以天祝白牦牛睾丸为材料,研究不同发育阶段睾丸中的差异表达蛋白质将为解释白牦牛睾丸发育和精子发生的分子机制提供参考,对提高白牦牛繁殖性能提供理论依据。本试验以1岁,2岁,4岁和8岁天祝白牦牛睾丸为实验材料,利用二维电泳和MALDI-TOF-TOF质谱技术鉴定不同发育时期差异表达蛋白质,分析这些差异表达蛋白质的功能及参与生物学过程或代谢途径。对筛选出的生殖候选基因热休克蛋白60(HSP60)进行分子克隆及在下丘脑-垂体-睾丸轴表达定位研究,进一步分析了HSP60对白牦牛睾丸支持细胞增殖的影响。本研究取得的主要结果如下:1、构建了白牦牛睾丸蛋白质表达图谱,经PDQuest 8.0.1分析发现白牦牛睾丸约有437个蛋白质点。比较了不同发育阶段差异蛋白质表达,结果显示在4个年龄阶段共有29个差异(p≤0.01)表达倍数在1.5倍以上的蛋白质点。其中,2种蛋白质随年龄上调,5种蛋白质随年龄下调,3种蛋白质在4岁前上调并随后下调,15种蛋白质在2岁前上调而后下调,4种蛋白质随年龄波动。2、对鉴定出的差异蛋白进行GO功能注释,这些蛋白质主要参与了“细胞过程、单有机体过程和新陈代谢过程”、“细胞、细胞器组成和胞外域”及“结合和催化活性”。亚细胞定位分析表明,鉴定蛋白主要位于细胞骨架(8个蛋白质),细胞核(6个蛋白质),线粒体(3个蛋白质)和细胞外基质(2个蛋白质)。3、选择2-DE检测的2个差异表达蛋白质(钙结合蛋白、热休克蛋白60)进行免疫印迹分析,结果显示所选蛋白的表达变化模式与2-DE结果基本一致,表明2-DE分析所得蛋白质差异表达结果可靠。4、对筛选出的差异蛋白HSP60进行分子克隆,发现白牦牛HSP60基因c DNA全长为2300bp,开放阅读框为1722bp,编码572个氨基酸。其理论分子量为60.977k Da、等电点为5.69,HSP60编码蛋白为非跨膜可溶性蛋白。氨基酸序列比对结果显示,白牦牛HSP60基因编码氨基酸序列与黄牛、瘤牛、绵羊、藏羚羊、骆驼、白犀牛、兔和黑猩猩的氨基酸序列同源性分别为100%、99%、99%、99%、99%、99%、98%和98%,说明HSP60在物种间高度保守。5、对HSP60表达及定位分析研究发现,HSP60基因及蛋白在白牦牛的下丘脑、垂体及睾丸组织中均有表达,其中下丘脑及垂体组织表达量高,睾丸组织表达量最低。免疫组化结果显示,HSP60蛋白表达于白牦牛下丘脑组织的室旁核大细胞,室旁核小细胞和神经角演网,垂体组织的腺细胞,睾丸组织的精原细胞,精母细胞,支持细胞和间质细胞,其中精子细胞中表达较弱。推断HSP60参与雄性白牦牛生殖轴调控,并参与睾丸发育与精子发生。6、进一步研究HSP60对原代培养的白牦牛睾丸支持细胞增殖的影响,通过构建HSP60过表达载体p IRES2-EGFP-HSP60,合成靶向si RNA沉默HSP60,瞬时转染支持细胞后,经RT-q PCR检测发现过表达组HSP60 m RNA在24、48和72h各时间点均上调,沉默组HSP60 m RNA在24、48和72h各时间点均下调。四氮唑盐法(MTS)检测细胞的增殖情况,过表达HSP60组,支持细胞增殖率各时间点均显著高于对照组。沉默HSP60组,支持细胞的增值率各时间点均低于对照组,但差异不显著。RT-q PCR检测细胞增殖标志基因细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)和增殖细胞核抗原(PCNA),发现过表达HSP60组Cyclin D1基因在48h时的表达显著高于对照组,PCNA基因的表达在24、48和72h时均显著高于对照组。沉默HSP60组Cyclin D1基因和PCNA基因的表达在24、48和72h时均低于对照组,但差异不显著。表明HSP60在白牦牛睾丸支持细胞增殖调控中的作用是正向调控。本研究通过差异蛋白质组学技术检测不同发育阶段睾丸蛋白质表达差异变化,筛选出HSP60与生殖相关,并对HSP60基因进行分子克隆及表达定位研究,原核表达系统诱导表达出融合蛋白His-HSP60,同时,对HSP60在睾丸支持细胞的增殖调控过程进行了初步研究,结果表明HSP60在白牦牛性机能的旺盛期是通过下丘脑-垂体-性腺轴来调控睾丸支持细胞增殖,进而影响睾丸发育,本实验为进一步研究雄性白牦牛精子发生提供了基础资料。