‘红阳’猕猴桃雄株离体再生与转基因技术研究

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猕猴桃(Actinidia chinensis Planch)是世界上重要的水果之一,营养丰富,特别是维生素C含量高。‘红阳’猕猴桃为中华猕猴桃的一个红肉优良品种,其口味独特,果肉中含有的红色花青素具有显著的抗衰老作用,深受消费者喜爱。猕猴桃为雌雄异株植物,雌株猕猴桃需要雄株授粉才能结果。大量的研究证明,雄株的花粉对雌株猕猴桃的产量和品质有显著的影响。‘红阳’猕猴桃在我国很多地方都有种植,但是没有统一的雄株品种。虽然猕猴桃雌株的组织培养得到了广泛的研究,但对猕猴桃雄株的离体再生技术研究甚少,其转基因技术尚未见报道。本课题先以四川省和陕西省四个不同果园的‘红阳’猕猴桃雄株为材料,比较了它们的茎段和叶片的表面消毒效果及形成芽的难易;然后以雄株MX1为材料,研究了植物激素对芽增殖和生根的影响,建立了其高效的快速无性繁殖技术;最后研究了根癌农杆菌介导的雄株MX1转基因的因素,并获得了转基因植株。所得到的主要结果如下:1.不同果园‘红阳’猕猴雄株的当年生茎段和叶片都很难消毒,但不同雄株的茎段或叶片形成芽的能力没有显著差异。用含1%有效氯的次氯酸钠溶液对不同的雄株茎段消毒20 min,污染率都很高,达到75%~95%;对叶片消毒15 min,污染率都在90%以上。培养基中添加广谱性抗菌剂Plant Preservative Mixture(PPM)(浓度0.2%,v/v)并不能有效地抑制茎段和叶的污染。在含1.0 mg/L BA和0.1 mg/L NAA的MS培养基上,四个雄株的没有污染且成活的茎段大都可以在5周内形成新的芽、叶片外植体在含0.5 mg/L TDZ和0.5 mg/L NAA的培养基上都可以形成愈伤组织,进而分化不定芽。2.各雄株茎段所形成的芽和叶片形成的不定芽都可以在含0.3 mg/L BA、0.3 mg/L GA3和0.1%(v/v)PPM的培养基上有效增殖。3.不同种类和浓度细胞分裂素对雄株MX1芽的增殖效果不同。在所试验的四种细胞分裂素(BA、TDZ、ZT和KT)中,BA的效果最好,最佳的BA浓度为0.5 mg/L;在含0.5 mg/L BA和0.3 mg/L GA3培养基上培养1个月,95%的MX1茎段可以形成丛生芽,平均增殖系数为5。4.在所试验的IBA、IAA和NAA三种生长素中,IBA诱导MX1芽生根效果最好,最佳浓度为0.5 mg/L,一个月内生根率达到95.5%,再生植株平均有8条根;再生植株移栽后,生长健康,45 d后的成活率为100%。5.在含3.0 mg/L BA和0.2 mg/L NAA的MS培养基上,MX1组培苗叶片外植体在30 d内可以都形成愈伤组织,并分化不定芽。在此培养基上添加50 mg/L卡那霉素(Kan)可以完全抑制MX1组培苗叶片形成愈伤组织和不定芽。6.以MX1组培苗叶片为外植体,研究了农杆菌菌液浓度、侵染时间、共培养基中乙酰丁香酮(AS)浓度和共培养时间对转基因效率的影响,发现农杆菌菌液浓度O.D.600值为0.5、叶片侵染时间为15 min、共培养基中AS浓度为100μM、共培养时间为3 d的转化效率最高。在优化的条件下,转基因植株的再生效率达到10%。转基因植株通过GUS染色法和PCR方法得到确认。
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