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金属元素是人体及动物生长必需的营养元素。镁和钼元素,它们参与机体正常的生理代谢过程,能够影响细胞的多种生理功能。机体处于镁或钼缺乏状态可能会引起多种疾病。镁的主要摄入来源是食物,但是由于人们食用的食物日益精制,导致镁元素的大量流失,因此镁摄入不足的现象越来越普遍。特别是一些高危人群,如老人、酗酒者等,镁缺乏的风险很高。食物中钼元素的含量主要受当地土地中钼元素含量的影响,在土壤中钼元素缺乏的地区,食物中的钼元素含量也很低,当地居民钼缺乏的风险很大。酵母细胞具有富集无机金属离子的能力,并能够将其转化为有机金属化合物,具有较高的生物吸收和利用率,并且具有较好的安全性。本研究通过微生物育种技术提高了酵母菌对金属离子的富集和有机化能力,分别获得富镁功能酵母和富钼功能酵母。
⑴富镁酵母的选育及相关研究。将高生物量菌株ZB-29-33-3(MATa,his)和高细胞镁含量菌株ZB-104-51-6(MATa,met)作为原生质体融合的亲株,通过原生质体融合构建了融合子ZBF-23,ZBF-65,ZBF-90,它们镁富集的能力优于它们的二倍体亲株ZB-29和ZB-104。将这三种融合菌株作为基因组改组的出发菌株。通过基因组改组获得了具有更强镁富集能力的富镁酵母Saccharomyces cerevisiae F3-3。基因组改组菌株F3-3的镁富集能力分别是原始菌株ZB-29和ZB-104的1.83和1.57倍。对富镁酵母F3-3发酵条件进行了研究,确定了摇瓶优化发酵条件为:葡萄糖40g/L,蛋白胨20g/L,酵母粉10g/L,镁离子浓度7g/L(添加醋酸镁),pH6.0,30℃,200rpm发酵30hr。优化的发酵条件下,细胞生物量(干重)可达16.16g/L,细胞镁含量达到14.26mg/g干细胞,重组菌株F3-3在优化发酵条件下细胞生物量和细胞镁含量是初始发酵条件下的1.38和1.26倍。在5L发酵罐中对富镁酵母发酵条件进行了进一步优化:总糖浓度为40g/L,底糖浓度15g/L,体积2.286L,流加糖浓度120g/L,流加糖体积714mL,流加速度119mL/hr,pH维持在5.O,溶氧控制在20%以上。接种量10%,30℃发酵18h。在此条件下细胞生物量可达41.38g/L(干重),细胞镁含量达到142.26mg/g干细胞,分别比优化摇瓶发酵条件下得到的生物量和细胞镁含量提高了2.69倍和9.92倍。检测了富镁酵母F3-3细胞中无机镁和有机镁的含量,并分析了富集的镁元素在细胞中的分布情况。酵母细胞富集的镁元素中约有95.7%转化为有机镁,其中主要和液泡、线粒体等细胞器结合;有一些与核酸和蛋白质等生物大分子结合。将富镁酵母F3-3的ALR1和MRS2基因片段序列与GenBank中酿酒酵母的ALR1和MRS2基因片段序列进行了比对,并比较了它们编码的氨基酸序列。
⑵富钼酵母的选育及发酵条件优化。将高生物量的ZD-5-21-17(MATa,lys)和高细胞钼含量的ZD-12-36-9(MATa,val),作为原生质体融合的亲株,通过原生质体融合构建了融合菌株Saccharomycescerevisiae HG-7,该菌株富集的总钼量分别是二倍体亲株ZD-5和ZD-12的1.92和1.53倍。对富钼酵母HG-7·发酵条件进行了研究,确定了摇瓶优化发酵条件为:糖浓度为80g/L的麦芽汁培养基,钼离子浓度1750μg/mL(添加钼酸钠),pH5.O~6.0,30℃,200rpm发酵48hr。优化的发酵条件下,细胞生物量(干重)可达11.12g/L,细胞镁含量达到3.15mg/g干细胞,融合菌株HG-7在优化发酵条件下细胞生物量和细胞钼含量是初始发酵条件下的1.23和28.64倍。检测了富钼酵母HG-7细胞中有机钼的含量约为92.95%。