副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus,VP)是一种革兰阴性嗜盐弧菌。常存在于近海岸海水、海产品及盐渍食品中,日本、美国和东南亚国家是其主要分布地区,是这些国家重要的食源性致病菌,当然也是我国沿海地区最常见的食物中毒病原菌,由VP菌引起的食物中毒案例约占这些地区食源性中毒案件的30％以上,浙江省则高达60％。当人们食用生的或烹煮不彻底的鱼、虾、蟹、贝等海产品时就有可能感染副溶血弧菌,表现为发热、恶心、呕吐、腹痛、腹泻等急性胃肠炎症状,严重者如治疗不及时有可能发展成败血症,引起死亡。由于VP菌的广泛流行和日益增高的中毒病例,很有必要对其致病机制进行深入研究。　　 副溶血弧菌在生存过程中是能形成生物膜的,跟霍乱弧菌,哈氏弧菌及创伤弧菌一样,生物膜在其适应环境和广泛传播过程中发挥着重要作用。副溶血弧菌OpaR,霍乱弧菌HapR及创伤弧菌SmcR均是哈氏弧菌LuxR的同源物,四者同为QS系统核心调控子。QS系统常常涉及到生物膜的形成,已有霍乱弧菌HapR调控生物膜形成的报道。早期的研究表明OpaR基因调控细菌的透明度和群集性爬动,但对其调控生物膜形成的详细机制研究少见。　　 目的:本研究目的在于探究副溶血弧菌RIMD2210633 OpaR调控子控制的生物膜表型,鉴定其靶基因,尤其是直接调控的靶基因,进一步研究OpaR对其下游直接靶基因的精细调控机制。　　 方法:本研究首先用自杀载体PDS132同源重组的方法敲除OpaR调控子,构建副溶血弧菌RIMD2210633菌株的ΔOpaR无痕突变株,然后比较野生株和Δ OpaR突变株在透明度、生长曲线及生物膜形成的一系列表型实验结果。其中生长曲线比较营养不同的M和MV5培养基在24℃和37℃两个温度下的生长状态,结晶紫染色作为生物膜定量分析方法。同时采用含His标签的pET28a为载体,大肠杆菌菌株BL21(DE3)为表达宿主,用实验室传统的重组克隆方法表达OpaR蛋白,镍柱纯化得到高纯度的His-OpaR蛋白,对其DNA结合活性进行分析:首先与其直系同源物进行序列比对,然后对自身基因及推定的生物膜相关基因启动子区设计引物进行EMSA,检测这些靶基因启动子区与Hs-OpaR蛋白结合活性,接下来的DNaseⅠ足迹实验则对二者结合区域作序列上的分析。　　 结果:用自杀载体PDS132同源重组的方法成功构建副溶血弧菌RIMD2210633菌株的Δ OpaR无痕突变株。表型实验中,在透明度分析上,Δ OpaR突变株是透明的,而野生株不透明,与文献相符；从生长曲线看,二者在富营养的M培养基中的生长状态无明显差异,而在低营养的MV5培养基,Δ OpaR无痕突变株生长状态比野生株好；生物膜结晶紫染色结果示△OpaR突变株生物膜形成能力要强于野生株。同时成功表达纯化了His-OpaR蛋白,序列比对结果示其与另三种弧菌的直系同源物存在高度同源性,自身基因OpaR(VP2516)及生物膜相关基因scrG(VP1377)的EMSA和DNaseⅠ足迹实验看出其有较高的DNA结合活性,同时也明确了它们与His-OpaR蛋白的结合序列,说明这两个基因受OpaR调控。　　 结论:本研究成功构建了副溶血弧菌RIMD2210633菌株的ΔOpaR无痕突变株,搭建了基于自杀载体的VP菌基因敲除方法的平台；生长曲线提示低营养条件下,OpaR基因能影响其生长状态；通过生物膜结晶紫染色估计OpaR可能通过某种机制抑制生物形成；EMSA和DNaseⅠ足迹实验说明OpaR作为QS系统的核心调控子,其具较高的DNA结合活性,DNaseⅠ足迹实验也明确了OpaR(VP2516)和scrG(VPl377)启动子与OpaR的结合序列,证明它们之间存在调控作用。但数据还不够汇总得出保守的OpaR box,然而上述研究为后续深入探讨OpaR调控子的详细调控机制,并绘制调控网络奠定了基础。