论文部分内容阅读
目的:3,3’-二吲哚甲烷(DIM)对癌症的治疗作用已被证实,但不同剂量的DIM对胃癌是否有不同作用尚不清楚,本研究旨在探讨低剂量的抗肿瘤药物DIM对胃癌细胞增殖、迁移及肿瘤干细胞特性的影响及作用机制,为揭示低剂量DIM在胃癌中的作用提供实验证据,同时也为DIM更好的应用临床提供新的实验依据和方法。方法:应用平板克隆形成实验分析低剂量的DIM对胃癌细胞增殖的影响,采用Western blot和免疫荧光检测低剂量的DIM作用胃癌细胞后增殖、迁移和干性相关蛋白及信号通路蛋白表达的变化情况。通过划痕实验和Transwell迁移实验检测低剂量的DIM对胃癌细胞迁移能力的影响。成脂诱导实验分析低剂量的DIM对胃癌细胞成脂分化潜能的影响。联合β-catenin通路抑制剂ICG001预处理,通过平板克隆形成实验、Western blot和成脂诱导实验验证低剂量的DIM是否通过活化β-catenin信号通路促进胃癌细胞增殖、迁移和增强其干性及分化潜能。采用TOP/FOP Flash荧光虫素酶报告基因检测低剂量的DIM对Wnt/β-catenin信号通路的活化情况。构建和包装PORCN、WNT4以及GFP对照慢病毒shRNA,并转染和筛选HGC-27稳定细胞株。运用q RT-PCR和Western blot检测PORCN、WNT4的敲减效率,通过平板克隆形成实验、Western blot、免疫荧光和成脂诱导实验评价低剂量的DIM对PORCN、WNT4敲减后的HGC-27细胞增殖、迁移、干性及分化潜能的影响。采用裸鼠皮下致瘤模型研究低剂量的DIM对胃癌细胞体内致瘤能力的影响,qRT-PCR检测瘤组织中Snail和N-cadherin的表达,免疫组化和免疫荧光检测瘤组织中Wnt4、β-catenin和CD44的表达。结果:体外实验结果显示高剂量的DIM显著抑制胃癌细胞增殖,而低剂量的DIM能促进胃癌细胞增殖蛋白PCNA和Cyclin-D3的表达、迁移相关蛋白N-cadherin、Vimentin的上调和E-cadherin的下调,增强其干性蛋白CD44、Sall4、Oct4、Cmyc和Sox2的表达。研究显示低剂量的DIM对胃癌细胞增殖、迁移和干性的促进作用与Wnt/β-catenin信号通路的活化有关,且该作用可被β-catenin抑制剂ICG001所逆转;干扰WNT分子自分泌后,DIM的这种作用即可逆转,证明低剂量的DIM可能通过促进WNT分子自分泌促进胃癌干性及进展;筛检HGC-27细胞中WNT分子的表达发现WNT4明显上调,将其敲减后,低剂量的DIM对胃癌细胞的促增殖、促迁移、干性上调作用明显减弱。裸鼠皮下致瘤实验表明,低剂量的DIM预处理的胃癌细胞体内致瘤能力明显增强。免疫组化、免疫荧光结果显示低剂量DIM作用组瘤组织中Wnt4、β-catenin和CD44表达都明显增强。结论:低剂量的DIM通过诱导Wnt4自分泌途径活化β-catnin信号通路促进胃癌细胞增殖、迁移并增强其干性,促进体内胃癌的发展。