研究背景肝细胞癌（HCC）是临床上一种常见的恶性肿瘤,发病率高,预后差,早期诊断困难及治疗手段有限。为了寻找肝癌新的诊断与治疗方法,人们越来越关注肝癌新的致癌基因的发现和功能研究。文献报道,LGALS3BP与多种恶性肿瘤生长、转移有关。我们前期通过SDS-PAGE电泳对正常人、HCC患者血清中的总蛋白进行分离,随后用质谱技术对差异表达蛋白进行鉴定,发现与正常人相比,肝癌患者血清中LGALS3BP水平显著性增加。但是LGALS3BP基因在肝癌细胞中的生物学功能尚不清楚。因此,本项目在前期研究基础上,进一步探索LGALS3BP在肝癌组织与癌旁组织或正常组织间的差异,并分析其与肝癌患者预后的相关性;通过构建干扰RNA（shRNA）慢病毒载体敲减肝癌细胞LGALS3BP表达,研究LGALS3BP对肝癌细胞增殖、凋亡、迁移及侵袭力的影响与作用;通过RNA-seq高通量测序,分析敲减LGALS3BP基因后肝癌细胞转录基因组学的变化,并通过生物信息学分析,探索LGALS3BP基因参与肝癌细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭的可能机制;通过Real-time PCR验证GO、KEGG、GSEA富集分析部分显著差异基因的表达,分析富集分析的可靠性,为下一步深入研究LGALS3BP基因致癌机制提供实验依据,为临床肝癌防治提供新的诊断标志物及新的治疗靶点。第1章LGALS3BP在肝癌组织中的差异性表达及其与肝癌预后的相关性分析目的研究LGALS3BP在肝癌组织中的差异性表达及其与肝癌预后的关系。方法1.通过UALCAN网站进入TCGA数据库,下载肝癌组织样本及正常肝组织样本资料,分析LGALS3BP基因在肝癌组织和正常肝组织中的表达。2.通过UALCAN网站进入TCGA数据库分析LGALS3BP基因表达与肝癌病理分级的关系。3.通过UALCAN网站进入TCGA数据库分析LGALS3BP基因表达与肝癌病理分期的关系。4.利用GEPIA数据库分析LGALS3BP mRNA在肝癌组织表达水平与总生存期（OS）相关性。5.免疫组化检测手术切除的肝癌组织和癌旁组织LGALS3BP的表达,利用赛维尔图像分析系统自动读取组织测量区域,进行阳性等级划分（0～3）并分别计算阳性面积比、平均光密度值、阳性面密度、H-score。结果1.在TCGA数据库中获得肝癌样本371例,正常肝组织样本50例。通过UALCAN数据库分析发现肝癌组织中LGALS3BP的表达明显高于正常肝组织,差异具有统计学意义（P＜0.05）。2.UALCAN数据库分析结果表明,肝癌组织中LGALS3BP表达水平与肝癌病理分级相关（P＜0.05）。3.UALCAN数据库分析结果表明,肝癌组织中LGALS3BP表达水平与肝癌病理分期相关（P＜0.05）。4.利用GEPIA数据库分析发现肝癌组织中LGALS3BP高表达患者总生存时间（OS）比低表达患者短,差异有统计学意义（P＜0.05）,提示LGALS3BP高表达患者预后不良。5.免疫组化检测发现LGALS3BP在肝癌组织中的表达明显高于癌旁组织（P＜0.05）。LGALS3BP蛋白质表达阳性面积（%）、平均密度、面积密度、H-Score,肝癌组织分别为68.46±7.69、0.077±0.006、0.053±0.009、115.98±11.44;癌旁组织分别为15.79±0.58、0.009±0.004、0.001±0.000、63.19±6.82;两组比较差异均具有显著性（均P＜0.05）。第2章LGALS3BP在肝癌细胞中的生物学功能目的在构建LGALS3BP基因干扰RNA（shRNA）慢病毒载体基础上,研究LGALS3BP在肝癌细胞中的生物学功能,重点观察LGALS3BP对肝癌细胞增殖、细胞周期、凋亡、迁移与侵袭的影响。方法1.构建LGALS3BP-shRNA慢病毒载体和建立稳定感染细胞株。包括慢病毒干扰RNA（shRNA）克隆的制备、慢病毒包装与质量检测、内源shRNA有效靶点的筛选、稳定慢病毒感染的人肝癌细胞株的建立。2.实验分组及处理。Huh-7细胞分2组,其中NC组用CON313慢病毒处理（编号CON313）;KD组用插入LV-LGALS3BP-shRNA片段的慢病毒（编号94272-1）处理。Huh-7细胞病毒感染72h后,通过荧光显微镜下观察细胞GFP荧光蛋白表达情况。当细胞状态良好,且荧光率大于70%,收集细胞做下一步的实验。3.CCK-8细胞活性检测。将处于对数生长期的NC组和KD组细胞消化后,重悬成细胞悬液,并计数。按每孔100μL细胞悬液接种于5张96孔板（2000个细胞/每孔）,每组做3个复孔。每隔24 h向其中一块96孔板中,按每孔10μL的量加入CCK溶液,培养箱内孵育2 h后,用酶标仪测定在450 nm处的吸光度,连续测定5次。4.细胞周期检测。通过流式细胞术检测肝癌细胞huh-7碘化丙啶（Propidium,PI）荧光强度,计算出各周期时相（G1期,S期以及G2/M期）细胞占细胞总数的比例。5.细胞凋亡检测。肝癌细胞huh-7经与APC-Annexin V结合后进行流式检测,统计细胞凋亡百分比。6.Celigo划痕实验。在Celigo划痕实验中,用专用的划痕工具制造划痕,Celigo识别细胞并拍照。然后利用软件分析相同视野内细胞迁移0h、迁移24h、迁移48h后的图像,计算出实验细胞在24h、48h的迁移率,判断该huh-7细胞迁移能力强弱。7.Transwell实验。huh-7细胞接种于Transwell小室中,铺板量为105,培养144h后取出小室,固定细胞、染色,显微镜下拍照,并对放大倍数为200倍的照片进行细胞计数分析,判断huh-7的运动转移能力。8.侵袭实验。huh-7细胞接种于侵袭小室中,铺板量为105,培养144h后取出小室,染色,显微镜下拍照,并对放大倍数为200倍的照片进行细胞计数分析,判断huh-7的侵袭能力。结果1.LGALS3BP-Sh RNA慢病毒载体构建成功,其阳性克隆测序结果与LGALS3BP基因序列一致。2.慢病毒感染72h后,PCR检测各样品基因表达,其中NC组、KD1组、KD2组、KD3组LGALS3BP基因相对表达量2-ΔΔCt分别为1.002±0.002、0.282±0.016、0.215±0.013、0.150±0.003;相比NC组,KD1组、KD2组、KD3组LGALS3BP基因相对表达量明显减少,差异有统计学意义（P＜0.05）。KD1组、KD2组、KD3组LGALS3BP基因敲减效率分别为71.8%、78.5%、85.0%,与NC组比较,差异有统计学意义（P＜0.05）。3.KD组CCK8 OD450值第1-5天分别是0.217±0.006、0.289±0.005、0.369±0.004、0.966±0.058、0.966±0.058;NC组第1-5天分别是0.226±0.003、0.292±0.005、0.450±0.006、2.013±0.017、2.013±0.017;与NC组比较,KD组第4天、第5天OD450值明显减少,差异均有统计学意义（P＜0.05）。KD组第1-5天细胞增殖倍数（OD450/fold）分别是1.000±0.029、1.335±0.025、1.702±0.021、3.045±0.028、4.459±0.266;NC组分别是1.000±0.014、1.290±0.023、1.989±0.025、3.845±0.044、8.905±0.077;与NC组比较,KD组第4天、第5天细胞增殖倍数（OD450/fold）明显减少,差异均有统计学意义（P＜0.05）。4.慢病毒感染48h后,KD组G1期、S期、G2/M期细胞百分比（%）分别是37.557±1.199、45.263±1.404、17.180±0.491,NC组G1期、S期、G2/M期细胞百分比（%）分别是45.990±0.609、42.317±1.260、11.697±0.668。其中,KD组处于G1期细胞百分比（%）少于NC组,差异均有统计学意义（P＜0.05）;KD组G2/M期细胞百分比（%）多于NC组,差异均有统计学意义（P＜0.05）。KD组S期细胞百分比（%）多于NC组,差异无统计学意义（P＞0.05）。5.慢病毒感染48h后,KD组、NC组huh-7细胞凋亡百分比（%）分别是5.827±0.192和1.637±0.107,KD组huh-7早期凋亡的百分比（%）明显高于NC组,差异有统计学意义（P＜0.05）。6.划痕24h及48h后,Celigo扫描读板发现KD组无细胞的划痕区域面积较NC组明显减少;KD组huh-7细胞迁移率（%）及迁移倍数分别为12.51±3.01、25.23±1.87;NC组huh-7细胞迁移率（%）及迁移倍数分别为20.56±4.55、47.00±2.51。相比NC组,KD组Celigo划痕24h及48h后huh-7细胞迁移率（%）及迁移倍数较NC组均明显下降,差异有统计学意义（P＜0.05）。7.Huh-7接种Transwell培养144h后,KD组上室huh-7细胞密度较NC组明显减少;KD组每个视野迁移的huh-7细胞数及迁移倍数分别为24.00±0.017、0.56±0.017;NC组每个视野迁移的huh-7细胞数及迁移倍数分别为43.00±0.026、1.00±0.026。相比NC组,KD组Transwell培养144h后每个视野迁移的huh-7细胞数及迁移倍数明显减少,差异有统计学意义（P＜0.05）。8.huh-7接种侵袭小室培养144h后,KD组上室huh-7细胞密度较NC组明显减少;KD组每个视野侵袭的huh-7细胞数及侵袭倍数分别为28.19±1.118、0.49±0.020;NC组每个视野侵袭的huh-7细胞数及侵袭倍数分别为56.93±1.992、1.00±0.035。相比NC组,KD组侵袭小室培养144h后每个视野侵袭的huh-7细胞数及侵袭倍数明显减少,差异有统计学意义（P＜0.05）。第3章LGALS3BP基因对肝癌细胞转录基因组学的影响及生物信息学分析目的我们在第2章研究发现LGALS3BP基因能够促进肝癌细胞增殖、抑制凋亡,同时促进肝癌细胞迁移、侵袭,但是相应的机制不明。本章拟从mRNA水平研究LGALS3BP基因敲减后肝癌细胞转录基因组学的变化,并进行生物信息学分析,初步揭示LGALS3BP基因促癌机制。方法1.实验分组及处理。Huh-7细胞分2组,其中NC组用CON313慢病毒处理（编号CON313）;KD组用插入LV-LGALS3BP-shRNA片段的慢病毒（编号94272-1）处理。Huh-7细胞病毒感染72h后,通过荧光显微镜下观察细胞GFP荧光蛋白表达情况。2.文库构建与质检。从样品中提取总RNA,然后通过Oligo（d T）磁珠富集带有poly A尾的mRNA,将所得RNA随机打断成片段,再用随机引物和逆转录酶从RNA片段合成cDNA片段。然后进行cDNA片段的末端修复以及测序接头（adapter）的连接,借助AMPure XP beads对cDNA进行筛选（250～300 bp左右）,然后再次PCR扩增,再利用AMPure XP beads对PCR产物进行纯化,最终获得所需要的文库。3.上机测序。库检合格后,把不同文库按照有效浓度及目标下机数据量的需求pooling后进行Illumina测序。4.测序数据分析。重点进行差异基因表达分析、差异基因富集分析（GO、KEGG、GSEA）。其中GSEA富集分析仅对KEGG等基因数据集进行GSEA分析。5.Real-time PCR检测Huh-7细胞与IL-17信号通路有关差异基因mRNA的表达,验证KEGG、GSEA富集分析结果。结果1.两组样本共筛选出1711个差异基因,其中有1337个差异表达基因上调,374个差异表达基因下调。2.GO通路富集分析发现所有差异基因集在6566条GO功能分类中富集,上调差异基因集在5902条GO功能分类中富集,下调差异基因集在122条GO功能分类中富集。以padj＜0.05作为显著性富集的阈值,所有差异基因集在170条GO功能分类中显著性富集,上调差异基因集在164条GO功能分类中显著性富集,下调差异基因集在83条GO功能分类中显著性富集。3.KEGG通路富集分析发现所有差异基因集在292条KEGG通路中富集,上调差异基因集在269条KEGG通路中富集,下调差异基因集在198条不同KEGG通路中富集。以padj＜0.05作为为显著性富集的阈值,发现所有的差异基因集在下列KEGG通路中显著富集:KEGGID为hsa04974、hsa04512、hsa04978、hsa04360、hsa04080、hsa04060、hsa04657、hsa03008。4.GSEA富集分析发现,IL-17信号通路上的CXCL5、CXCL8、SRSF1、IKBKE、CXCL3、CXCL2、CXCL10、FOSL1基因富集在KD组明显减少,与KEGG富集分析一致。5.慢病毒感染72h后,Real-time PCR检测Huh-7细胞与IL-17信号通路有关差异基因mRNA的表达,除CXCL10外,KD组样品中CXCL5、CXCL8、SRSF1、IKBKE、CXCL3、CXCL2、FOSL1表达明显减少,差异有统计学意义（P＜0.05）,结果与KEGG、GSEA富集分析一致。总结论1.肝癌组织中的LGALS3BP表达水平显著性高于癌旁/正常组织,LGALS3BP高表达的HCC患者预后不良;2.LGALS3BP基因具有促进肝癌细胞增殖、迁移、侵袭,抑制肝癌细胞凋亡的作用;3.敲减LGALS3BP基因后,肝癌细胞转录基因组发生显著性变化;NC组和KD组之间存在1711个差异基因,上调基因1337个,下调基因374个;其中IL-17信号通路基因集相关分子CXCL5、CXCL8、SRSF1、IKBKE、CXCL3、CXCL2、FOSL1显著性下调,说明LGALS3BP基因可能通过IL-17信号通路影响肝癌细胞的生物学功能。