基因打靶技术CRISPR/Cas9系统和TALEN在水稻中的深入研究

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近年来,生命科学领域出现一系列基因组定点修饰技术,比如大范围核酸酶(meganuclease) or归位内切酶(homing endonuclease), ZFN(锌指核酸酶),转录激活因子样效应核酸酶(TALEN),以及最新刚开发出来的CRISPR/Cas9系统。这些技术的出现不但给基因功能研究带来了巨大的便利,并且对人类众多疾病的治疗以及农作物改良具有巨大的潜在价值。在这些技术中,TALEN和CRISPR/Cas9系统是目前最受关注并且在各个模式生物中应用地最好的两个系统。单子叶植物水稻既是人类主要的粮食作物源泉,也是植物生物学研究中的模式植物。在这份研究中,研究了TALEN和CRISPR/Cas9两种系统在介导水稻基因组定点修饰中的功效以及这些修饰在水稻中的多样性,可遗传性和突变类型额偏好性及突变发生的时空特性。通过研究我们发现,虽然TALEN和CRISPR/Cas9系统都能成功地介导水稻基因组的定点突变并遗传给后代但是CRISPR/Cas9系统诱导突变的效率明显要比TALEN高。由CRISPR/Cas9系统介导的定点突变的平均效率能够达到在50%以上,而TALEN的效率最高只有6.6%。为了进一步提高TALEN系统地打靶效率,我们分别或同时截短了TALEN骨架的氨基端或羧基端长度,结果发现两个羧基端缩短的TALEN骨架N287C63和N287C14在介导突变的效率上比最初的TALEN骨架N287C230有极大的提升(N287C63,N287C14和N287C230的靶位点是一样的,唯一的变化就是两个N287C14之间的间隔从15个碱基对缩减至了13个碱基对),它们的效率分别达到了25.0%和21.7%。另外,CRISPR/Cas9系统在介导突变的过程中倾向于影响单个碱基的变化(72.4%)而且主要是通过单个碱基的插入(高于50%)来改变原序列;然而,TALEN系统更加倾向于影响多个碱基的变化(82.10%)并且基本上是导致多碱基的删除(69.88%)。所以,通过我们的实验我们发现,TALEN和CRISPR/Cas9两种系统都能有效地介导水稻基因组的定点突变并且它们介导的突变都是可遗传的,大多数的突变都发生在早期顶端分生组织中;但是这两种系统在介导突变的效率上,产生的突变的类型的偏好性很大的不同。本研究为今后将这两个系统进一步应用于水稻的基因定点修饰提供了理论依据和操作经验,并显示了该项技术在作物改良发面蕴藏的巨大的价值。
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