γ-亚麻酸生产菌的工艺优化及菌种选育

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γ-亚麻酸(γ-linolenicacid)是一种人体必需的多不饱和脂肪酸,它以其独特的生理机能日益引起人们的重视。微生物发酵生产γ-亚麻酸也成为国内外研究的热点之一。本文以雅致小克银汉霉(Cunninghamellaelegants)为研究对象,从检测方法、摇瓶工艺优化,菌种初步选育等方面,对γ-亚麻酸发酵作了相应的研究。   GLA的检测需要经过菌体干燥、油脂提取、甲酯衍生化和气相分析四个过程,因而快速、有效的分析方法的建立是十分重要的。经过实验确定了较好的检测条件:菌体干燥的温度和时间分别为80℃和16h;油脂提取时间和水浴温度分别为12h为75℃;皂化时间和甲酯化时间对衍生化影响最大;气相分析过程中柱温为190℃,分流比为120:1,GLA保留时间约为9min。   在摇瓶工艺优化过程中,主要考虑了温度、pH、溶氧、接种、发酵时间五个因数对发酵的影响,并确定了相应参数的最佳条件:温度为28℃,pH为6,转速为200rpm,装量为100mL(500mL三角瓶),种龄为44h,接种量为12%,发酵时间为8d。在此基础上,对碳源、氮源、植物油、甘油、非离子表面活性剂、柠檬酸(盐)、微量元素分别进行了研究,并通过正交实验确定了较好的发酵培养基:葡萄糖15%,酵母膏1.5%,花生油2.0%,柠檬酸/柠檬酸三钠(1:1)0.5%,吐温-200.8%,KH2PO40.3%,NaNO30.5%,MgSO4·7H2O0.05%,GLA的含量为1.49g/L。   经过对GLA代谢途径的研究,确定了选育高产菌株的方法-抗性筛选法,并确定了筛选培养基的配方:PDA+110mg/L.失水苹果酰肼,因为失水苹果酰肼是脂肪酸脱氢酶的抑制剂。在此基础上,应用离子注入对菌种进行诱变,并确定了最佳方法:注入能量为10KeV,注入剂量为250×1013ions/cm2~300×1013ions/cm2。经过诱变后,得到一株高产菌株,GLA产量为1.70g/L,比对照提高了14%。
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