恶性黑色素瘤（malignant melanoma，MM）多好发于皮肤、粘膜。是起源于胚胎期神经嵴的恶性肿瘤，易转移，预后较差，发病率为全部恶性肿瘤的1％~3％。然而近十几年来，恶性黑色素瘤的发病率日益增加。传统的手术、放化疗一直是恶性黑色素瘤治疗的主要方法，但对于晚期患者来说，手术治疗无生存获益，且其对放疗和化疗敏感性欠佳。近年来，随着黑色素瘤相关突变基因的发现与深入研究，分子靶向药物为其治疗带来了突破性进展。因此，探索更多的有效靶点成为了当前首要任务。　　表皮生长因子受体（Epidermal growth factor receptor，EGFR）分子量为170kDa，是一种参与细胞增殖、存活、转移的蛋白质。表皮生长因子（Epidermal growth factor，EGF）为其配体，当EGFR受到刺激后，可与EGF发生结合，产生构型变化，形成同源或异源二聚体，使其胞内段受体酪氨酸激酶发生自身磷酸化，进而激活其下游通路。其中主要包括Ras/Raf/MEK/ERK、PI3K/AKT通路等。目前有研究证明，包括黑色素瘤在内的人多种恶性肿瘤中均可发现有EGFR过表达现象的存在，且EGFR的表达水平可与治疗效果差、疾病恶化快以及存活率低有关。　　小凹蛋白-1（caveolin-1,Cav-1）是分子量为21-24kDa的膜内在蛋白，是膜内陷囊泡的重要结构蛋白。Cav-1由178个氨基酸残基组成，位于肽链中的疏水残基（102-134）在膜结构上形成特殊的发卡样结构，将Cav-1蛋白分成N端及C端两个区域，其中N端为主要的功能区域，该区域通过与EGFR相连接，调控EGFR酪氨酸激酶的活性。目前已有多项研究显示，Cav-1可在不同恶性肿瘤中发挥抑制或促进的作用。然而Cav-1通过调控EGFR在恶性黑色素瘤细胞中发挥作用的研究尚未见报道。　　根据预实验结果提示，恶性黑色素瘤UACC647细胞中的Cav-1的表达量明显高于M2细胞，而M2细胞中Cav-1表达量较少。故本次研究分别以高表达Cav-1的UACC647细胞和低表达Cav-1的M2细胞为研究对象，通过质粒稳定转染技术，改变两组细胞中Cav-1的表达水平，通过对比Cav-1水平改变前后恶性黑色素瘤细胞增殖、迁移、侵袭能力的变化，探讨Cav-1对恶性黑色素瘤细胞生物学行为的影响，并进而探讨其可能存在的分子机制。为恶性黑色素瘤的新靶点的探索以及治疗预后提供新的理论依据。　　方法：　　1、细胞转染　　选取高表达Cav-1的UACC647细胞，分别转染Ctrl shRNA和Cav-1shRNA质粒，嘌呤霉素进行抗性筛选，从而构建稳定转染的UACC647Ctrl shRNA[UACC647（Ctrl）]和UACC647Cav-1shRNA[UACC647（KD）]细胞。另外选取低表达Cav-1的M2细胞，分别转染pcDNA3.1和pcDNA3.1/Cav-1质粒，G418进行抗性筛选，进而构建稳定转染的M2（pcDNA3.1）和M2（pcDNA3.1/Cav-1）[M2（Cav-1）]细胞。Western blot验证Cav-1表达情况。　　2、MTS实验检测细胞增殖能力　　将细胞接种于96孔板中，待细胞贴壁后加入不同浓度的EGF溶液刺激，培养一定时间后检测各孔的吸光度值（OD）。　　3、细胞划痕修复实验检测细胞迁移能力　　将细胞接种于24孔板中，待形成单细胞层后用移液器枪头进行划痕，观察在有或无EGF刺激下细胞的迁移情况，在不同时间点拍照记录，直至划痕愈合。　　4、Transwell小室侵袭实验检测细胞侵袭能力　　将细胞接种于Transwell小室中，置于37℃、5％CO2培养箱中培养24h。观察并统计穿膜细胞数。　　5、Western blot检测蛋白表达水平　　分别用终浓度为20nM EGF的培养基培养UACC647(Ctrl)和UACC647(KD)细胞以及M2(pcDNA3.1)和M2(Cav-1)细胞，培养时间分别为0、5、10、30min。提取各组细胞总蛋白。将蛋白样品等体积上样，电泳、转膜、孵育抗体，分别检测UACC647(Ctrl)和UACC647(KD)细胞以及M2(pcDNA3.1)和M2(Cav-1)细胞中EGFR、pY-EGFR、Akt、p-Akt、Erk、p-Erk、Cav-1和?-actin的蛋白表达水平，测量灰度值，分别计算各组细胞磷酸化EGFR、Akt和Erk占总EGFR、Akt和Erk的相对值。　　结果　　1、稳定转染细胞株中Cav-1蛋白表达量　　蛋白印迹检测UACC647(Ctrl)和UACC647(KD)细胞中Cav-1的蛋白表达量，测得的相对灰度值分别为（0.84±0.03，0.24±0.01）。与相应的其他两组细胞相比，UACC647(KD)细胞Cav-1蛋白表达水平明显降低，差异有显著性（P＜0.01）。M2(pcDNA3.1)和M2(Cav-1)细胞中Cav-1表达量的相对灰度值分别是（0.83±0.08，2.01±0.21）。与相应的其他两组相比，M2(Cav-1)细胞中Cav-1蛋白表达明显增高，差异有显著性（P＜0.01）。　　2、Cav-1表达对恶性黑色素瘤细胞增殖能力的影响　　采用MTS法，检测抑制Cav-1表达水平后，UACC647细胞增殖能力的变化。在不同浓度EGF（4nM、20nM、100nM）刺激下，与UACC647(Ctrl)细胞相比，低表达Cav-1的UACC647(KD)细胞生长活力均有所增高（0.78±0.02vs.0.88±0.04、0.86±0.01vs.1.03±0.03、0.98±0.03vs.1.15±0.03），且差异有显著性（P＜0.05）。MTS法检测过表达Cav-1表达水平后，M2细胞增殖能力的变化。在终浓度分别为0nM、4nM、20nM、100nM的EGF刺激下，与M2(pcDNA3.1)细胞相比，M2(Cav-1)细胞生长活力均有所下降（0.92±0.03vs.0.63±0.05、1.03±0.11vs.0.73±0.06、1.10±0.10vs.0.80±0.02、1.22±0.09vs.0.89±0.03），差异均有显著性（P＜0.01）。　　3、Cav-1表达对恶性黑色素瘤细胞迁移能力的影响　　利用细胞划痕修复实验，检测敲低Cav-1表达水平后，UACC647细胞迁移能力的变化。每间隔8h，在各组细胞划痕固定位置拍照，直至划痕愈合。以初始划痕宽度为1，计算各时间点划痕宽度相对值。在没有EGF刺激条件下，各时间点均可见低表达Cav-1的UACC647(KD)细胞划痕愈合速度较快，划痕相对宽度值均小于正常表达Cav-1的UACC647(Ctrl)细胞（0.72±0.02vs.0.87±0.02、0.67±0.01vs.0.81±0.03、0.46±0.01vs.0.76±0.01），差异有显著性（P＜0.01）。当存在EGF刺激条件下，UACC647(KD)细胞在各拍照时间点愈合速度均较快，划痕相对宽度明显小于UACC647(Ctrl)细胞（0.57±0.03vs.0.75±0.02、0.28±0.03vs.0.68±0.02、0.09±0.01vs.0.49±0.01），差异有显著性（P＜0.01）。同样方法检测M2(Cav-1)细胞的迁移能力。每间隔5h，在各组细胞划痕固定位置拍照。在没有EGF刺激条件下，M2(Cav-1)细胞划痕愈合速度较慢，在各个时间点划痕愈合的相对宽度均大于M2(pcDNA3.1)细胞（0.92±0.03vs.0.72±0.02、0.81±0.05vs.0.57±0.03、0.65±0.01vs.0.34±0.04），差异有显著性（P＜0.01）。当存在EGF刺激条件下，M2(Cav-1)细胞在各时间点愈合速度同样慢于M2（pcDNA3.1）细胞，其划痕相对宽度明显较大（0.82±0.03vs.0.63±0.03、0.73±0.02vs.0.42±0.02、0.46±0.03vs.0.00±0.00），差异均有显著性（P＜0.01）。　　4、Cav-1表达对恶性黑色素瘤细胞侵袭能力的影响　　利用transwell小室侵袭实验，检测敲低Cav-1表达水平后，UACC647细胞侵袭能力的变化。可见，与UACC647(Ctrl)细胞相比，低表达Cav-1的UACC647(KD)细胞侵袭能力增强，穿过Transwell小室滤膜的细胞数量相对增高（1±0.00vs.2.37±0.09），差异有显著性（P＜0.01）。同样方法检测过表达Cav-1后，M2细胞侵袭能力的变化。与M2(pcDNA3.1)细胞相比，M2(Cav-1)细胞侵袭能力减弱。穿过Transwell小室滤膜的细胞数相对值明显降低（1±0.00vs.0.59±0.08），差异具有显著性（P＜0.01）。　　结论：　　1、敲低Cav-1表达可促进人恶性黑色素瘤细胞增殖、迁移和侵袭能力；　　2、过表达Cav-1可抑制人恶性黑色素瘤细胞增殖、迁移和侵袭能力；　　3、Cav-1可通过调控EGFR的活化水平，可以抑制其下游的Ras/Raf/MEK/ERK和PI3K/AKT信号通路，进而抑制恶性黑色素瘤细胞的生长。