研究背景恶性肿瘤作为一种严重危害人类生命健康的主要因素,是目前直接导致人类死亡的重要疾病,并且不同恶性肿瘤在严重威胁了患者的身心健康的同时,给肿瘤患者的家庭及社会都带来了异常沉重的经济压力[1]。肝细胞癌(以下简称肝癌)是世界第5大常见恶性肿瘤,根据我国肿瘤大数据在2014年的统计结果显示,肝癌致死的病例数约为31.9万、新发的病例数为36.5万,是高发病率、高致死率的恶性肿瘤,患者的5年总体生存率不足10%,防治形势极其严峻[2]。肝癌的发生是一个典型的多步骤、多阶段演变发展过程,很多患者在确诊时可能就已进展至中晚期,此时已错失根治性治疗的机会,所以提高肝癌治疗临床疗效的根本途径还是提高肿瘤的早期诊断率以进行早期治疗。目前临床上主要依靠甲胎蛋白(α-fetoprotein,AFP)血清学检查和影像学检查对肿瘤进行检测、诊断和监测,但整体效果却差强人意[3]。目前主流治疗方案有手术切除、肝移植、介入治疗、靶向治疗、免疫治疗等,早期肝癌的首选治疗方式为肝移植及手术切除。但是这些治疗措施对于提高肝癌患者的生存率存在很大的局限性,并且在很多行手术切除的患者中存在复发的可能性,尤其是在伴有血管侵犯的患者中更为突出。从相关对于肝细胞肝癌治疗方案的文献中可以看出:肝移植的5年生存率是60%～80%,小肝癌手术切除的术后5年生存率是50%～60%,大肝癌手术切除的术后5年生存率是30%--40%,小肝癌射频消融术的术后5年生存率是30%-40%。若能寻找到新的敏感性更高、特异性更强的生物学标记物,对于改善肝癌患者的生存预后意义重大。蛋白激酶家族CLK(CDK-likekinase)是一种双特异性蛋白激酶,可以催化蛋白质的丝氨酸残基。主要是通过酪氨酸、丝氨酸/苏氨酸残基底物蛋白磷酸化调控细胞内信号转导。蛋白激酶家族CLK可以分为四个亚型:CLK1、CLK2、CLK3和CLK4。因为这四个亚型编码的蛋白质C端都有一个高度保守的基因序列并且具有同样一个结构类似的氨基酸序列,所以此类蛋白激酶也被称之为LA MMER蛋白激酶[4-6],蛋白激酶家族CLK可以通过调控一系列的细胞的结构和功能从而发挥生命体调节作用。其中CLK2亚型被发现于大部分真核生物中,其对SR蛋白的结构域进行磷酸化从而调节RNA的选择性剪接,但是目前CLK2主要作用的功能以及其调节机制仍不是很明确[7]。有研究证实禁食能够将CLK2启动激活,此项研究提示CLK2可能在肝脏中糖异生和脂肪酸的氧化发挥着重要作用[8]。同时有研究发现CLK2能够通过苏氨酸343位点进行磷酸化调控,促进PGC-1α蛋白的磷酸化,继而抑制肝脏糖异生和肝糖原的代谢分解[9]。此外有基础研究发现CLK2参与寿命的调控,并且CLK2的突变体能够参与调控延长秀丽隐杆线虫的周期寿命[10]。但截至目前有关CLK2基因在肝细胞肝癌中的相关报道甚少,CLK2在HCC中的表达情况以及和预后的关系也尚不清楚。微小RNA(microRNA,即miRNA)是一种长度约为21-23nt、进化高度保守的内源性非编码的小RNA[11]。它首先从内含子中被RNA聚合酶Ⅱ转录,在细胞核中生成了 pri-miRNA,然后运送到胞浆加工成为成熟的miRNA,成熟的mi RNA能够被运载到RISC沉默复合体上,和RISC沉默复合体一起,miRNA能够序列特异性的识别靶基因mRNA3’非翻译区(UTRs)通过降解靶基因mRNA或者抑制靶基因mRNA翻译沉默基因的表达。人体中有将近33%的蛋白编码基因都会受到miRNA的控制,每一个miRNA可以直接调控的靶基因约有200个。越来越多的证据表明,miRNAs在许多生物学过程中发挥重要的作用,约有百分之五十的miRNAs和多种人类肿瘤有关[12-16],这并不是一个偶然的事件。D ouglasHanahan等在肿瘤的标志性特征:下一代中指出多种不同的细胞类型组合在一起并协作形成不同类型并逐步恶化的癌症,认为肿瘤的复杂临床和生物学表型是一些基本规律和机制的表现[17]。持续的增殖信号,回避生长抑制调控,抗细胞凋亡,永久复制能力,新生血管增生以及侵袭和转移是肿瘤形成过程中的6个标志性特征,参与了肿瘤形成的主动过程。从既往的科学研究来看,有许多已经在不同类型的肿瘤中证实了功能的miRNAs,参与了肿瘤发生发展以及转移的各个阶段,这些miRNAs发挥的作用各不相同,有一些可以作为致癌基因起作用,有一些可以作为抑癌基因发挥作用。近年来对相关microRNAs的研究结果提示,与配对的非癌组织相比,有很多种miRNA在HCC中呈异常表达(上调或下调)。大量的研究以及证实异常表达的microRNAs能够通过其特有的转录调节机制,参与了肝癌进展的很多过程[14,16,18,19]。已有许多研究证实,microRNAs对于肝癌的发生和发展起到重要作用,可以参与到肝癌细胞的增殖、分化以及凋亡等环节,因此研究microRNAs对于探索肝癌进展有着重要的意义。miRNA-497作为miRNA-15/16/195/424/497的家族成员的一员,此家族在人体内组织中有中到高丰度的表达,其成熟成熟的miRNAs 5’端均含有AGCAGC序列,可以称之为一簇高度保守的miRNA。已经有大量文献报道,miRNA-497可以通过调控细胞周期和一些细胞信号转导途径如PI3K-A KT-mTOR信号途径和MAPK/ERK信号途径等中关键分子的表达,进而促进细胞凋亡、抑制细胞增生[20-33]。从目前的研究可以提示在抑制肿瘤发生发展中m iRNA-497可能具有重要作用,有希望成为肿瘤诊治的一个潜在的新靶点。目前为止,miR-497在多种肿瘤中异常表达并影响肿瘤细胞的分化、生长、增值、侵袭、迁移、细胞凋亡和细胞周期等,已经被大量科学研究所证实[20-33]。CreeveyL等学者在其研究中证实,miRNA-497是通过与Weel基因靶向结合,下调Weel基因的表达量,从而减弱对有丝分裂的抑制作用,最终使得肿瘤细胞分裂不受控制,这是miRNA-497参与细胞周期的调节的机制[20]。而针对多种肿瘤的研究中,在乳腺癌中已有研究证实了,由于DNA的甲基化而使miRNA-497表达降低,后续降低了对MAPK/ERK信号途径的抑制作用,使RAF基因呈过度表达状态、细胞生长增值加速,同时通过荧光酶报告基因实验证实RAF-1是mi RNA-497的靶基因,miRNA-497的含量与肿瘤的恶性程度成负相关[25,29]。在视网膜母细胞瘤中miR-497表达水平明显下调,其通过靶向VEGFA显着降低细胞增殖,并且影响了视网膜母细胞瘤细胞内迁移和侵袭能力。在骨肉瘤中miR-497 能够促进骨肉瘤细胞的凋亡,它是通过抑制 MAPK/Erk 信号通路的表达来启动P21的表达,从而促进肿瘤细胞的凋亡[20]。在膀胱癌中miR-497呈低表达状态,主要是通过调节与肿瘤转移相关的蛋白,例如波形蛋白、钙黏蛋白、α-SMA,进而影响膀胱癌细胞的转移[30]。但是截至目前,在肝癌中有关于miR-497的相关报导较少,其在肝癌中的功能和作用尚不完全明确,有待于进一步研究。本课题研究中,我们在前期实验中通过大样本肝癌公共数据库中的表达谱数据进行深度分析,证实CLK2 mRNA表达水平在肝癌组织中呈显著升高,并且发现异常升高的CLK2和肝癌临床恶性表型具有高度相关性,并证实CLK2的高表达是影响肝癌患者总体生存预后的独立危险因素。基于以上研究背景,我们推测CLK2基因可能是一种促癌基因。所以我们基于体内外实验系统的研究了 CL K2基因在HCC中的表达水平及临床预后诊断意义和价值,并对进一步的机制研究进行了初步的探索,为CLK2作为肝癌精准治疗的靶点提供了一定的理论基础。最后我们又通过基于生物信息学分析,推测CLK2可能受miRNA-497调控,并在正常组织与肝癌组织中监测miRNA-497的含量,通过体外试验进一步转染miR NA-497观察对肝癌细胞CLK2表达的影响。最终发现miRNA-497/CLK2调节轴在和肝癌的发生发展密切相关,为其可能成为肝癌治疗的新靶点奠定理论基础。第一部分CLK2在肝癌组织中的表达及临床意义目的:通过TCGA和GEO数据库以及肝癌组织芯片分析CLK2在肝癌中的表达水平,并研究其与肝癌临床特征和预后的关系。研究方法:1.下载全部的包括HCC在内的、具有公开权限的多种肿瘤数据,探索CL K2基因mRNA在各种正常组织和癌组织中的表达情况;2.利用应用非常广泛的TCGA和GEO两大公共数据库中的大样本、多中心肝癌表达谱,对肝癌组织中CLK2 mRNA的表达水平进行分析;3.利用TCGA和GEO等公共数据库中提供的临床随访资料,对CLK2 mR NA在正常组织和肝癌组织中的表达、以及和肝癌临床表型之间的关系进行分析。4.构建肝癌组织芯片队列,基于免疫组织化学技术和组织芯片检测CLK2蛋白水平在肝癌组织中的表达情况,分析了 CLK2蛋白表达丰度和肝癌患者临床特征及预后之间的关系。研究结果:1.TCGA数据库中CLK2的表达:CLK2 mRNA在大多肿瘤中呈异常表达,在肝癌组织中,和正常肝组织相比,CLK2-mRNA表达水平呈显着上调。2.肝癌GEO数据库中CLK2的表达:CLK2 mRNA在大部分肝癌GEO表达谱数据集中表达水平呈显着上调水平。3.TCGA肝癌表达谱数据集的生存分析结果显示:CLK2高表达提示较差的总生存期和无进展生存期。4.根据免疫组织化学染色方法检测CLK2的表达水平结果,与对应的癌旁组织相比,收集的95例肝癌组织中CLK2表达水平明显升高,差异有统计学意义。CLK2表达水平与肝癌临床病理参数的分析结果表明:CLK2表达水平TNM分期和生存预后和密切相关;4.根据免疫组织化学染色方法检测CLK2的表达,肝癌组织中CLK2在肝癌组织中显著高表达,CLK2的表达水平与TNM分期、肿瘤分化程度有关,而C LK2蛋白在肝癌组织标本中的表达水平与患者年龄、性别、瘤体大小等无统计学关联。结论:1,CLK2在肝癌组织表达水平高于正常肝组织;2,CLK2的表达水平和肝癌患者TNM分期、转移等临床恶性表型及临床预后密切相关。3,CLK2可能是潜在的肝癌预后判断标志物。第二部分CLK2对肝癌细胞生物学行为影响的体内外研究目的:探讨CLK2在肝癌增殖、侵袭、迁移转移中的调节作用及其分子机制,旨在从新的角度阐明肝癌发生发展的机制,为寻找新的肝癌治疗靶点提供理论依据。方法:1.应用WesternBlot方法检测CLK2蛋白在8对肝癌及相应配对癌旁组织中的表达情况;检测肝癌组织中的表达;2.利用慢病毒技术在肝癌细胞中干扰表达CLK2,并通过Westemblot检测C LK2干扰表达效率,并成功建立CLK2稳定沉默的肝癌细胞株(sh-CLK2)及阴性对照组(NC)。4.采用CCK-8法观察干扰表达CLK2后SK-Hep-1和SMMC-7721肝癌细胞活性变化情况,EDU检测细胞增殖能力情况,细胞划痕实验检测细胞迁移能力的变化,Transwell实验检测细胞侵袭能力的变化,克隆形成实验检测细胞克隆形成的变化。5.将上述建立的CLK2稳定沉默肝癌细胞株(sh-CLK2)和空病毒对照组(L enti-blank)细胞株注入裸鼠皮下,建立裸鼠皮下移植瘤模型,在体内观察CLK2对肝癌生物学行为的影响;6.通过公用数据库利用生物信息学进行GO分析、KEGG通路分析、GSEA以及GSVA分析,预测CLK2参与肝癌进展的下游信号通路,并用westernblot、免疫组织化学技术进行后续验证。结果:1.WesternBlot方法证实CLK2蛋白在肝癌组织中较配对癌旁组织高表达。2.转染sh-CLK2沉默慢病毒的肝癌细胞中CLK2表达水平明显降低,成功建立L enti-blank(空慢病毒载体转导),Lenti-sh-CLK2(干扰CLK2表达慢病毒载体)的SK-Hep-1和SMMC-7721两种细胞系。3.在细胞实验中,CLK2干扰表达后肝癌细胞系的增殖能力明显下降,迁移、侵袭能力以及克隆形成能力均下降,差异有统计学意义(P＜0.05)。4.在体内实验中,和转染空病毒的裸鼠组相比,CLK2干扰表达后肝癌细胞成瘤能力、肿瘤重量均明显下降,差异有统计学意义(P<0.05)。5.通过生物信息学技术对差异表达基因进行GO分析及KEGG通路分析、GSVA分析提示,差异表达基因主要与WNT/β-catenin信号通路有关。且进一步Wester nblot及免疫组织化学染色方法提示CLK2表达水平与WNT/β-catenin通路相关蛋白β-catenin,wnt3a的表达呈正相关性,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:1.上调的CLK2蛋白能够促进肝癌增殖、迁移、侵袭及成瘤能力;2.CLK2可能通过启动WNT/β-catenin信号通路参与到肝癌的发生发展中。第三部分miRNA-497/CLK2信号调节轴在肝癌进展中的作用目的:利用生物信息学技术对能够靶向CLK2基因的microRNA进行筛选和鉴定,并且在体外验证此microRNA对肝癌细胞生物学行为的影响方法:1.在肝癌细胞中过表达或抑制miR-497,应用RT-PCR方法和Westernblot分别检测CLK2表达水平变化,并分析miR-497和CLK2的表达相关性。2.利用双荧光素酶试验验证miR-497对CLK2的靶向结合调控作用。3.细胞生物行为的功能回复实验:分别建立过表达miR-497-mimics组和CLK2、miR-497mimics&CLK2组后,检测研究其对肝癌细胞的生长增值(CCK-8)、迁移(细胞划痕)、侵袭(transwell)和克隆形成的生物学行为的影响,明确miR-497是否通过调控CLK2抑制肝癌细胞恶性表型。4.下游通路蛋白的功能回复实验:进一步利用Westernblot方法检测miR-497-mi mics 组和 miR-497mimics&CLK2 组 CLK2 表达水平与 WNT/β-catenin 通路相关蛋白WNT-3a和β-catenin的表达,明确miR-497是否通过调控CLK2参与启动W NT/β-catenin 通路。结果:1.生物信息学分析结果提示CLK2可能是miR-497的靶基因。2.miR-497的表达水平在肝癌组织中较正常组织显着降低(p<0.05),且CLK2的表达水平呈显着负相关;RT-PCR方法及westernblot方法实验证实过表达或抑制m iR-497对CLK2表达水平有明显影响,双荧光素酶报告实验进一步证实CLK2为miR-497的靶基因。3.miR-497过表达后,肝癌细胞系的增殖能力、侵袭能力、克隆形成能力均明显下降,与CLK2敲除有相似的效果,同时加入CLK2高表达基因后可部分抵消m iR-497对肝癌组织的抑制作用。从而证实了 miR-497通过转录后水平负性调控C LK2参与调控肝癌的侵袭、转移和克隆形成能力。4.进一步利用Westernblot及免疫组织化学染色方法提示CLK2表达水平与WNT/β-catenin通路相关蛋白β-catenin和WNT-3a的表达呈正相关性,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:1.miR-497能够靶向调控CLK2的表达。2.miR-497/CLK2调节轴参与对肝癌患者临床预后的影响。全文结论:1.CLK2在肝癌中表达明显升高,并和患者TNM分期和肿瘤分化程度等临床恶性表型密切相关,同时CLK2低表达患者的生存时间明显长于CLK2高表达的患者;2.在体内外干扰CLK2表达后,肝癌的增殖能力显着下降,侵袭以成瘤能力明显下降提示CLK2在肝癌的发生和发展过程中起到促癌基因作用。3.CLK2能够启动肝癌细胞WNT/β-catenin通路;4.肝癌细胞中CLK2收到miR-497的靶向调控,miR-497通过负性调节其靶基因CLK2的蛋白表达,从而抑制肝癌进展。同时,患者的总体生存时间同时受到miR-497和CLK2共同表达水平的调控。miR-497/CLK2调节轴在肝癌的发生发展中起到了重要作用,有可能成为肝癌治疗的新靶点。