马传染性贫血病毒(Equine infectious anemia virus, EIAV)是感染马属动物的慢病毒。EIAV中国弱毒疫苗株,是可诱导针对同源或异质EIAV毒株的良好免疫保护并唯一被成功大规模应用的慢病毒疫苗。以该弱毒疫苗系统作为慢病毒疫苗的研究模型,明确其致弱和诱导免疫保护的机制,将对慢病毒免疫机制研究和有效疫苗研制提供有益参考,具有重要的理论意义和应用价值。本文选择马传染性贫血中国驴胎皮肤细胞适应性弱毒疫苗株EIAVFDDV13作为研究对象,对其生物学特性在已有研究基础上做进一步深入探讨。关注的重点放在对该弱毒疫苗的病毒种群构成与诱导保护性免疫、弱毒疫苗诱导的超感染抵制现象(Super-infection resistance, SIR)与固有免疫激活和特异性免疫应答建立之间是否具有相关性等问题的回答。首先,我们比较了弱毒疫苗株EIAVFDDV13和一株拯救于EIAVFDDV13前病毒DNA的分子克隆毒株EIAVFDDV3-8在诱导免疫保护上的差异。基于攻毒试验和对攻毒后无症状马匹进行免疫抑制的试验结果,我们发现EIAVFDDV13免疫马匹诱导出了5/6的发病保护和3/6的完全保护,而EIAVFDDV3-8仅诱导出了2/7的发病保护和未能实现完全保护。同时,前者免疫马匹的血清对致病毒株的中和能力要明显优于后者。上述研究表明,疫苗感染性克隆毒株显然丢掉了亲本疫苗弱毒株诱导免疫保护的能力。此外,比较二者对体外培养巨噬细胞(Monocyte derived macrophage, MDM)的固有免疫激活特征时,发现二者在固有免疫相关分子Toll样受体和I型干扰素(IFNα/β)的诱导上存在差异,而已有研究证明这些差异与特异性免疫应答的建立具有联系。这提示病毒株可能通过对感染早期固有免疫的激活影响最终建立的特异性免疫应答,而疫苗弱毒株和疫苗感染性克隆毒株通过何种机制诱导差异的固有免疫激活,以及进一步影响后续的特异性免疫应答,则需要进一步的研究予以阐明。而在病毒株方面,考虑到两毒株在体内、外复制特性上不存在显著差异,我们进一步对二者的gp90基因进行了分析,以探讨感染性克隆毒诱导免疫保护能力丢失的原因。分析结果提示,EIAVFDDV13抗原构成呈高度多样性特征,而EIAVFDDV3-8则构成相对单一且其基因背景源于亲本疫苗多样性的组成成分。由此,我们推测上述差异,是EIAVFDDV3-8未能复制亲本疫苗诱导免疫保护能力的原因。拯救带有疫苗多样性组分囊膜基因的多个感染性克隆毒株,并进行免疫诱导差异比较,是用于验证上述推测所需开展的进一步试验研究。而该差异是否与固有免疫激活存在相关性,亦需要做进一步探讨。其次,本研究中我们开展了有关EIAV中国弱毒疫苗诱导超SIR的相关研究。SIR是指一种病毒感染宿主细胞后,可以诱导细胞产生抵抗相同和近似病毒超感染的能力。包括HFV、EIAV在内的慢病毒可诱导SIR。本研究中,我们使用EIAVFDDV13和有致病力的EIAV感染性克隆毒株EIAVUK3作为慢病毒强、弱毒株的模式毒株,就二者在诱导SIR能力上是否存在差异进行了比较研究。基于可特异性区分强、弱毒株的病毒定量PCR (qPCR)和病毒RNA原位杂交技术(ViewRNA)证实,EIAVFDDY13体外感染宿主细胞MDM后诱导的针对EIAVUK3株的SIR,要强于EIAVUK3诱导的针对EIAVFDDY13的干扰作用。基于分支链DNA检测技术(Branch DNA)进一步证实,EIAVFDDY13感染MDM后,相对于EIAVUK3感染组,其上调了细胞内可溶性病毒受体ELR-IN、TLR3、INFβ和Tetherin等分子的表达。这些分子可对EIAV在MDM内的感染和复制过程通过不同机制产生抑制作用。通过适量Poly I:C激活MDM内的TLR3,可在MDM细胞中模拟出近似于EIAVFDDY13感染MDM后细胞内上述分子的表达水平,且该状态细胞获得了抵抗EIAV感染的能力。据此,推测TLR3通路的激活,在EIAVFDDY13诱导更强的SIR中发挥重要作用。此外,考虑到Toll样受体、I型干扰素等在激活固有免疫和调节特异性免疫应答中发挥的重要作用,EIAV强、弱毒株间诱导的SIR差异与二者激活固有免疫应答时的差异,并借由该差异进一步影响到特应性免应答的建立,尤其是疫苗诱导的保护性免疫应答建立的相关性和作用机制,是需要进一步关注和阐明的问题。本论文获得的上述研究结果,将促进我们对EIAV中国弱毒疫苗株生物学特性的更多了解。同时,基于对该疫苗株诱导保护性免疫机制的探讨,也将为如何设计可诱导保护性免疫的慢病毒疫苗提供参考。尽管把弱毒疫苗作为慢病毒疫苗的设计策略应用于HIV疫苗的研究,还存在争议。但在全世界投入了巨大的人力、物力,耗费了近30年的时间用于HIV相关研究,而取得的结果却只是在攻克疫苗诱导免疫保护难关上举步维艰时,对作为AIDS动物模型的EIA的研究,特别是成功的诱导了免疫保护的中国EIAV弱毒疫苗的作用机制研究,这种“从成功中学习”的策略,无疑具有其不可替代的价值。