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研究背景间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells,MSCs)是干细胞的一种,具有多向分化潜能,能够不断自我更新,并在特定条件下分化成为一种或多种构成机体组织或器官的细胞。MSCs在组织工程上已经得到广泛应用,在骨类疾病、神经退行性疾病等疾病治疗中也有较多研究。虽然MSCs具有广泛的临床应用前景,但是,由于存在体外大量增殖和定向诱导分化等问题制约了其进一步应用,因此,如何解决以上问题成为这个领域的研究热点与难点。近年来,电磁辐射对干细胞的影响开始受到关注。据报道,一定条件的电磁辐射暴露可影响MSCs的增殖和分化,但有关电磁脉冲(Electromagnetic pulse,EMP)对MSCs的生物学效应研究尚未见报道,有关射频辐射(Radio-frequency radiation,RF)对MSCs的生物学效应研究也较少。因此,本研究以目前应用比较广泛的人脐带间充质干细胞(Human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUC-MSCs)为研究对象,探讨了EMP和1950 MHz RF对hUC-MSCs增殖和分化的影响。研究目的明确EMP和1950MHz RF对hUC-MSCs增殖和成骨方向分化的影响,并初步阐明其作用机制。第一部分hUC-MSCs的培养和鉴定材料与方法1.从医院采集新生儿脐带,剥离华通氏胶,用组织块法分离培养MSCs,待细胞长至80%左右融合度后胰酶消化传代。取对数生长期的hUC-MSCs,接种96孔板,用CCK-8法每天检测细胞的生长情况,连续检测5天(d),绘制生长曲线。2.取原代培养至第3代对数生长期的hUC-MSCs,用流式细胞仪检测MSCs特异性表面抗原CD90、CD105和CD166的表达。研究结果1.组织块在培养至第7 d时已有较多细胞长出,贴壁生长,14 d左右细胞融合度可达90%以上,传代后细胞形态稳定,且具有间充质干细胞的典型形态。CCK-8检测结果显示,hUC-MSCs在接种后第2 d进入对数生长期,第4 d进入平台期,细胞倍增时间为32小时(h)。2.流式细胞仪鉴定结果显示,原代培养的细胞高度表达CD90、CD105和CD166,阳性细胞率在96%以上。第二部分EMP对hUC-MSCs增殖和成骨方向分化的影响材料与方法SPG200-EMP辐照源:场强720 kV/m,脉宽40 ns,重复频率1Hz,脉冲个数可设置为1~6000个。1.EMP对hUC-MSCs增殖的影响:1.1细胞分组和EMP暴露:选取第3~6代对数生长期的hUC-MSCs进行本部分实验。将细胞随机分为假暴露组(sham)和EMP暴露组(EMP组),然后进行单次或多次(1次/d,连续3 d)EMP暴露或假暴露,每次暴露的EMP脉冲个数为10个、100个和1000个。1.2检测方法:EMP暴露结束后第1 d、3 d、5 d和7 d用CCK-8法检测细胞增殖能力,流式细胞仪检测细胞周期和凋亡水平的变化。2.EMP对hUC-MSCs成骨方向分化的影响2.1细胞分组和EMP暴露:选取第3代对数生长期的hUC-MSCs进行本部分实验。将细胞随机分为sham组、EMP组、成骨诱导培养组(Osteogenic induction medium,OM)和OM+EMP组,然后进行单次或多次(1次/d)EMP暴露或假暴露,每次暴露的EMP脉冲个数为100个和1000个。2.2检测方法:微板法检测细胞中的碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)的活性,免疫印迹(Werstern blotting,WB)法检测成骨特异性蛋白COLⅠ、OPN的表达水平,茜红素染色检测钙化结节的形成情况。研究结果1.EMP对hUC-MSCs增殖的影响CCK-8检测结果显示,与sham组相比,10个脉冲EMP单次暴露结束后第1 d、3 d、5 d和7 d,hUC-MSCs的细胞活力无明显变化。100个和1000个脉冲EMP单次暴露结束后第1 d,hUC-MSCs的细胞活力无明显变化,第3 d、5 d和7 d细胞活力显著降低,100个和1000个脉冲组之间细胞活力无显著差异。与sham组相比,10个脉冲EMP重复暴露3次,在暴露结束后第1 d,hUC-MSCs的细胞活力无显著变化,第3 d和5 d细胞活力显著降低(分别为P<0.05和P<0.01)。100个和1000个脉冲EMP重复暴露3次,在暴露结束后第1 d、3 d和5 d,hUC-MSCs的细胞活力显著降低,100个和1000个脉冲组之间细胞活力无明显差异。与10个脉冲EMP单次暴露组相比,10个脉冲3次暴露组在暴露结束后第1 d,hUC-MSCs活力无显著变化,第3 d和5 d细胞活力显著降低。与单次暴露组相比,100个和1000个脉冲组在暴露3次结束后第1 d、3 d和5 d细胞活力显著降低。流式细胞仪检测结果显示,与sham组相比,100个脉冲EMP暴露结束后24 h,hUC-MSCs的细胞周期分布发生显著性变化,S期细胞所占比例显著下降(P<0.01),G1期细胞所占比例显著上升(P<0.05)。细胞凋亡水平无显著变化。2.EMP对hUC-MSC成骨分化的影响ALP活性检测结果显示,与sham组相比,100个和1000个脉冲单次暴露后第21 d,hUC-MSCs中的ALP活性无明显变化。与OM组相比,OM+EMP组的hUC-MSCs经100个和1000个脉冲EMP单次暴露后,在成骨诱导培养的第21 d,细胞中的ALP活性显著增加(P<0.05),100个和1000个脉冲组之间ALP活性无明显差异。与sham组相比,100个脉冲EMP重复暴露7次(1次/d,连续7 d)后,hUC-MSCs的ALP活性无明显变化。与OM组相比,100个脉冲EMP单次暴露,OM+EMP组hUC-MSCs在成骨诱导培养的第7 d和14 d,细胞中的ALP活性没有显著变化,在成骨诱导培养的第21 d,hUC-MSCs的ALP活性显著增加(P<0.05)。100个脉冲EMP重复暴露4次(1次/d,连续4 d),OM+EMP组hUC-MSCs在成骨诱导培养的第7 d,细胞中的ALP活性与OM组相比无显著变化,在成骨诱导培养第14 d和21d,hUC-MSCs中的ALP活性较OM组显著增加(分别为P<0.05和P<0.01)。100个脉冲EMP重复暴露7次(1次/d,连续7 d),OM+EMP组hUC-MSCs在成骨诱导培养的第7 d、14 d和21 d,细胞中的ALP活性较OM组均显著增加(分别为P<0.05,P<0.05和P<0.01)。WB检测结果显示,与OM组相比,hUC-MSCs经100个脉冲EMP重复暴露7次(1次/d,连续7 d),在成骨诱导培养的第14 d和21 d,OM+EMP组中细胞中的COLⅠ和OPN的蛋白表达量均显著增加(P<0.01)。茜红素染色结果显示,在成骨诱导培养的第21 d,OM+EMP组中的钙化结节面积较OM组显著增加(P<0.01)。第三部分1950 MHz射频辐射对hUC-MSCs增殖和成骨方向分化的影响材料与方法射频(Radio frequency,RF)辐射源:频率1950 MHz,比吸收率(Specific absorption rate,SAR)可设置为0~4.0 W/kg,暴露时间可调。1.RF对hUC-MSCs增殖的影响1.1细胞分组和RF暴露:选取第3~6代对数生长期的hUC-MSCs进行实验,将细胞随机分为假暴露组(sham)和暴露组,然后将细胞假暴露或暴露于频率为1950 MHz,SAR值分别为0.5,1.0和2.0 W/kg的RF中,每天暴露1 h(5 min开,10 min关),连续暴露7 d。1.2检测方法:暴露结束后,用CCK-8法检测细胞活力,连续检测6 d,流式细胞仪检测细胞周期,免疫荧光法检测增殖相关蛋白Ki67的表达。2.RF对hUC-MSCs成骨方向分化的影响2.1细胞分组和RF暴露:选取第3代对数生长期的hUC-MSCs进行实验,将细胞随机分为假暴露组(sham),射频电磁辐射组(RF组),OM组和OM+RF组,然后将细胞假暴露或暴露于频率为1950 MHz,SAR值为2.0 W/kg的RF中,每天1 h(5 min开,10 min关),连续暴露7 d。2.2检测方法:暴露结束后,用微板法检测细胞中ALP活性。研究结果1.CCK-8法检测结果显示,与sham组相比,不同SAR值RF暴露7 d后,hUC-MSCs的增殖能力无明显变化,流式细胞仪和免疫荧光法检测结果显示,与sham组相比,hUC-MSCs的细胞周期分布及Ki67蛋白水平也无显著改变。2.ALP活性检测结果显示,与sham组相比,hUC-MSCs经SAR值为2.0 W/kg的RF暴露7 d后,细胞中的ALP活性无显著变化。与OM组相比,OM+RF组的ALP活性亦无显著改变。研究结论1.场强720 kV/m,脉宽40 ns,频率1 Hz,脉冲个数为10的EMP单次暴露对hUC-MSCs的增殖能力无明显影响,多次重复暴露则会抑制细胞的增殖能力。100个和1000个脉冲EMP单次暴露即可显著抑制细胞的增殖能力,多次重复暴露后,抑制作用更明显,但都不会引起细胞凋亡。2.场强720 kV/m,脉宽40 ns,频率1 Hz,脉冲个数100和1000的EMP单独暴露对hUC-MSCs不具有成骨分化诱导作用,但能够增强成骨诱导培养基对hUC-MSCs的成骨分化诱导作用,且随重复暴露次数增加,效应越明显。3.SAR值分别为0.5、1.0和2.0 W/kg的1950 MHz RF,每天1 h,连续暴露7 d对hUC-MSCs增殖无显著影响。4.SAR值为2.0 W/kg的1950 MHz RF,每天暴露1 h,连续暴露7 d对hUC-MSC无成骨分化诱导效应,对成骨诱导剂的成骨分化效应也无明显影响。5.提示EMP可以作为一种新的方法应用于MSC的成骨分化。