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研究目的:血管性认知障碍（Vascular Cognitive Impairment,VCI）是由脑血管病危险因素或各种脑血管病引起的从轻度认知损害到痴呆的一大类综合征,在所有痴呆类型中占第二位。VCI起病隐匿,诊断后无有效治疗方法,给社会和家庭带来沉重的经济和精神负担,寻找有效的VCI治疗途径意义重大。我们团队前期研究发现,血管性危险因素所致的脑白质损伤,即少突胶质细胞系或髓鞘损伤是VCI的重要致病机制之一。星形胶质细胞是脑中数量最多、分布最广的免疫细胞,大量研究表明星形胶质细胞参与了白质髓鞘的整个发育分化成熟过程。在缺血低氧等病理刺激下,星形胶质细胞激活为反应性星形胶质细胞（Reactive Astrocytes,RAS）,现有研究证明RAS的数量和功能是一个随时间而变化的连续动态过程。P2X7受体是嘌呤受体2（Purinergic Receptors,P2Rs）家族中的一员,主要分布在星形胶质细胞表面,是多种途径细胞信号转导及细胞毒性介导的重要受体之一。因此在本研究中,我们拟建立VCI小鼠模型,研究不同时间点RAS对VCI脑白质髓鞘修复的影响,同时对P2X7在其中的作用及相关机制进行探讨。第一部分不同时间点VCI小鼠星形胶质细胞活化与少突胶质细胞和髓鞘蛋白损伤程度的相关性研究研究方法:利用双侧颈总动脉结扎法（Bilateral Common Carotid Artery Occlusion,BCCAO）构建VCI小鼠模型。将动物分为Sham组、24h VCI组、3d VCI组、7d VCI组、15d VCI组和30d VCI组共六组。通过Morris水迷宫（Morris Water Maze,MWM）、悬尾不动实验（Tail Suspension Test,TST）和强迫游泳实验（Forced Swimming Test,FST）观察VCI小鼠学习记忆能力及情绪的改变。在纹状体、胼胝体和海马三个区域,通过免疫荧光染色胶质原纤维酸性蛋白（Glial fibrillary acidic protein,GFAP）结合形态学变化对RAS进行计数,观察RAS在VCI术后不同时间点活化程度的变化;免疫荧光染色GST-pi和髓鞘碱性蛋白（Myelin Basic Protein,MBP）,观察VCI术后不同时间点脑白质髓鞘损伤情况。同时对不同时间点VCI小鼠脑白质不同区域RAS与OLs及MBP变化趋势进行分析。结果:五组VCI小鼠学习记忆及情绪障碍在术后15d达到高峰,在30d时有所缓解,但仍重于Sham组。纹状体和海马区RAS在7d达到最高,随后开始降低;胼胝体区域RAS在VCI术后7d和15d均处于较高水平,但两者比较无统计学意义。纹状体、胼胝体和海马区域的GST-pi、MBP在术后15d时达到最低值,在30d时回升。小结:小鼠学习记忆及情绪等变化与脑白质髓鞘标记物GST-pi、MBP的变化是一致的,即GST-pi、MBP表达最低（脑白质损伤最严重的）的时间点（VCI术后15天）,也是VCI小鼠认知功能受损最严重的时候。但RAS活化程度最高的时间点早于髓鞘损伤和行为学障碍最严重的时间点。表明VCI小鼠术后学习记忆及情绪等行为学改变与脑白质中RAS活化情况和白质髓鞘损伤变化在时间上有相关性。VCI术后7-15天可能是比较重要的时间点。第二部分不同时间点VCI小鼠P2X7受体和活化星形胶质细胞功能的相关性研究研究方法:实验动物和分组同第一部分。在纹状体、胼胝体和海马三个区域,免疫荧光双标GFAP和P2X7,GFAP和iNOS以及GFAP和GDNF,观察VCI术后不同时间点RAS上P2X7以及炎症因子iNOS和神经营养因子GDNF的表达情况。WB检测脑白质中GLT-1水平,观察VCI术后不同时间点RAS的GLT-1表达情况。结果:与Sham组相比,在纹状体,胼胝体和海马区,五组VCI小鼠术后RAS上P2X7表达均升高（所有p＜0.05）。RAS上P2X7表达在7d达到高峰,30d达到最低。RAS上表达的iNOS,在三个脑白质区均在术后7d达到高峰。脑白质区GLT-1在术后7d和15d均较低（两个时间点比较无统计学意义）且在30d有所回升（vs.15d VCI组,p＜0.05）。纹状体区GDNF在术后24h出现上升,随后开始下降,30d达到最低;在胼胝体区15d达到最低,30d有所回升;在海马区7d达到最低,15d有所回升。小结:VCI小鼠术后脑白质中RAS上表达P2X7和重要促炎因子之一iNOS均在7d达到高峰,结合第一部分实验结果,RAS活化程度也是在7d达到高峰。表明无论是从活化程度还是功能上,VCI术后第7d可能是RAS炎症作用最严重的时候。代表RAS对兴奋性毒性谷氨酸摄取能力的GLT-1在术后7-15较低,RAS来源的GDNF在脑白质不同区域随时间轴变化到达最低时间有所不同,但在7-15天之间基本均处于较低状态。表明VCI术后7-15天RAS基本以促炎作用为主,作为主要表达在RAS上的P2X7受体可能在其中有重要作用。在术后7d对P2X7进行干预可能减轻炎症反应,保护脑白质髓鞘。第三部分拮抗P2X7受体对VCI小鼠活化星形胶质细胞功能状态及髓鞘修复影响的在体研究研究方法:实验动物同第一部分。将动物分为Sham组,VCI组,VCI+24h P2X7拮抗组和VCI+7d P2X7拮抗组共四组。选用P2X7受体特异性拮抗剂A-804598阻断P2X7相关通路的作用。行为学检测同第一部分。WB检测脑白质中P2X7和GLT-1水平,观察不同时间点脑白质中P2X7水平及RAS表达GLT-1情况。在纹状体、胼胝体和海马三个区域,免疫荧光双标GFAP和iNOS以及GFAP和GDNF,观察不同时间点RAS上iNOS和GDNF的表达情况;免疫荧光染色GST-pi和MBP,观察不同时间点脑白质髓鞘损伤情况。结果:与VCI组相比,VCI+24h P2X7拮抗组和VCI+7d P2X7拮抗组学习记忆及情绪等行为学均得到了改善,脑白质区的P2X7表达明显降低,GLT-1表达升高,纹状体、胼胝体和海马区iNOS表达显著降低,GST-pi和MBP表达增高。两个时间点拮抗组的GDNF在纹状体和胼胝体表达与VCI组无明显差异,在海马VCI+7d P2X7拮抗组高于VCI组（p＜0.05）。与VCI+24h P2X7拮抗组相比,VCI+7d P2X7拮抗组脑白质区GLT-1表达升高,iNOS表达降低,GST-pi升高;MBP在纹状体和胼胝体升高,在海马区升高但无统计学意义;GDNF在三个脑白质区域虽然升高但无统计学意义。小结:P2X7是RAS影响VCI小鼠髓鞘修复过程中的重要受体之一,对其进行阻断有助于髓鞘修复,其机制可能与抑制RAS上的iNOS等促炎途径,促进GLT-1等兴奋性毒性氨基酸转运途径有关。术后7d拮抗P2X7受体的抑炎效果要优于术后24h拮抗组,VCI术后7d对P2X7进行干预可能是比较合适的时间点。第四部分拮抗P2X7受体对活化星形胶质细胞功能状态及少突胶质前体细胞成熟影响的体外研究研究方法:从新生24h的ICR小鼠中提取原代星形胶质细胞,培养并传代。建立体外星形胶质细胞氧糖剥夺（Oxygen-glucose deprivation,OGD）模型。加入P2X7特异性拮抗剂A-804598阻断RAS上的P2X7受体。按照不同处理方法将星形胶质细胞分5组:Sham组、1h OGD组、12h OGD组、1h P2X7拮抗组和12h P2X7拮抗组。从新生24h SD大鼠中提取原代OPCs培养增殖后,将OPCs分为5组:Sham组、1h OGD组、OGD12h组、1h P2X7拮抗组、12h P2X7拮抗组,依次向各组中加入收集的对应时间点的5组星形胶质细胞上清液,与正常OPCs分化培养基同时加入到分化阶段的OPCs中,每日换液,连续5天后收取细胞进行WB检测。WB检测5组星形胶质细胞裂解液中P2X7和GLT-1水平;酶联免疫吸附方法（Enzyme-linked Immunosorbent Assay,ELISA）检测iNOS和GDNF浓度。WB检测5组OPCs裂解液中MBP表达水平。结果:与未加入拮抗剂组相比,拮抗RAS上的P2X7受体后,拮抗组的P2X7和iNOS表达下降,GLT-1表达升高,MBP表达增加。与1h P2X7拮抗组相比,12h P2X7拮抗组P2X7（p＜0.01）和iNOS（p＜0.001）表达降低,MBP表达升高（p＜0.01）,GLT-1表达无明显区别（p＞0.05）。与Sham组相比,其余四组GDNF表达均增加,但四组之间比较无意义。小结:星形胶质细胞OGD造模1h和12h拮抗RAS上的P2X7受体均有利于髓鞘修复。在缺血缺氧条件下RAS上的P2X7受体对髓鞘修复有重要作用,其可能通过直接降低炎症因子表达,促进兴奋性毒性氨基酸转运,从而起到促进髓鞘成熟的保护作用。结论:P2X7是缺血缺氧后RAS损伤脑白质的重要受体之一,在合适的时间点对其进行阻断有助于髓鞘修复,从而改善VCI小鼠认知功能障碍,其机制可能与抑制RAS上的iNOS等促炎途径,促进GLT-1等兴奋性毒性氨基酸转运途径有关。该途径可作为VCI治疗的潜在重要治疗靶点。