论文部分内容阅读
4-羟苯丙酮酸二加氧酶(4-Hydroxyphenylpyruvate Dioxygenase, HPD),是一种参与酪氨酸代谢途径的代谢酶,主要在肝脏和肾脏表达,在其他组织呈现极低水平表达或不表达。前期研究表明HPD的表达异常及突变与可导致酪氨酸血症,此外在肝损伤过程中也发现HPD表达上调,提示HPD可能是肝损伤的重要标志物。我们实验室前期利用组织芯片、qRT-PCR和Western-Blotting等技术意外发现HPD在肺癌组织及细胞中高表达,而在癌旁组织中表达水平较低。但关于HPD在肺癌中异常表达的分子机制及其对肺癌细胞行为影响的研究,目前尚无任何报道。为进一步确证HPD与肺癌的关系,本课题进行了以下两方面的研究：第一部分：检测敲低HPD表达对化疗药物诱导的肺癌细胞系A549凋亡的影响。首先将前期设计的HPD RNA干涉片段克隆到慢病毒表达载体上,然后通过瞬转筛选得到干涉效果较明显的干涉载体,并包装病毒颗粒,感染肺癌细胞系,经嘌呤筛选得到敲低HPD的A549稳定细胞株及对照稳定株,用抗肿瘤药物Gefitinib处理以上各种稳定株,检测其凋亡情况。第二部分：构建了HPD基因启动子荧光素酶报告基因载体并进行了转录活性分析,初步探索了HPD的转录调控特点。首先利用UCSC在线数据库分析人HPD基因组结构,并获得其5’端上游启动子区域-2000 bp-+39bp的DNA)序列。以人基因组DNA为模板,克隆到pGL3-Basic载体上,设计不同引物,进一步构建系列缺失体,最后通过荧光素酶报告基因实验分析其转录活性。第三部分：通过生物信息学数据库预测HPD基因启动子序列上潜在的转录因子结合位点,并结合文献报道初步探索了HNF1α (Hepatocyte nuclear factor1α),HNF4a (Hepatocyte nuclear factor la)和Nrf2 (Nuclear factor, erythroid 2-like 2)等转录因子对HPD基因的转录调控作用。本论文发现敲低HPD表达增强了肺癌细胞A549对化疗药物Gefitinib的敏感性,构建了HPD启动子报告基因载体,明确了其在肺癌中特异表达的关键结构域,并发现HNF1α和Nrf2对HPD基因表达的调控作用。本论文初步揭示了HPD在肺癌中异常高表达的调控机制,为深入研究HPD的基因表达调控奠定了基础。