研究背景:鼻咽癌是我国尤其南方地区发病率较高的恶性肿瘤之一,其治疗手段以放疗为主,而肿瘤细胞的放射抗拒是导致放疗失败的主要原因。前期研究表明鼻咽癌的放射抗拒与Gadd45g、PUMA等基因异常表达相关,而姜黄素能够逆转鼻咽癌放射抗拒。进一步明确相关基因对鼻咽癌放射抗拒的产生机制并获得姜黄素的干预作用对临床治疗具有重要意义。目的:阐明鼻咽癌细胞放射抗拒的分子机制,探讨姜黄素在鼻咽癌细胞放射抗拒中的干预作用。方法:长期射线诱导鼻咽癌细胞放射抗拒株CNE-2R,芯片筛选鼻咽癌细胞放射敏感株CNE-2与抗拒株CNE-2R间的差异基因,获得高表达的Gadd45g、PUMA基因作为研究对象。基于CRISPR/Cas9技术构建Gadd45g与PUMA基因敲除载体,利用TIDE分析验证剪切效率,并通过RT-qPCR、WB实验验证敲除结果。克隆形成实验检测各组细胞的放射抗拒性。流式细胞术检测细胞的细胞周期变化。MTT法、划痕实验检测细胞的生长情况及迁移能力差异。克隆形成实验验证姜黄素的放射增敏作用,RT-qPCR实验检测姜黄素干预后的Gadd45g、PUMA基因表达差异,联合数据库分析共同获得姜黄素的干预作用。结果:CNE-2R中Gadd45g、PUMA基因的表达显著上调。成功构建Gadd45g与PUMA基因敲除载体,经转染后筛选获得Gadd45g基因敲除细胞株CNE-2R-KO,未能获得PUMA基因敲除细胞株。RT-qPCR和WB实验验证了 Gadd45g在CNE-2中低表达,在CNE-2R中高表达,而在CNE-2R-KO中表达水平明显降低。克隆形成实验验证了 CNE-2R细胞产生的射线抗性,同时证实CNE-2R-KO细胞敏感性显著提高。流式细胞术检测到CNE-2R和CNE-2相比,G1期比例降低,S期比例增加,表明细胞对射线抗拒性增加;CNE-2R-KO与CNE-2R相比,G1期比例明显增加,S期比例明显降低,表明细胞敏感性提高。MTT实验发现CNE-2R细胞的增殖速度比CNE-2细胞慢,而敲除Gadd45g基因会增强细胞增殖能力。划痕实验表明CNE-2R细胞迁移速度明显地强于CNE-2细胞,而CNE-2R-KO细胞迁移速度则变慢。克隆形成实验表明姜黄素具有放射增敏作用。RT-qPCR实验表明姜黄素可以降低PUMA表达,而对Gadd45g的表达改变无显著性差异,提示姜黄素的放射增敏分子机制与PUMA凋亡相关通路有关,而非Gadd45g相关通路。数据库分析表明姜黄素调控PUMA基因进而增强鼻咽癌放射敏感性的机制可能与EGFR相关。结论:鼻咽癌细胞放射抗拒性的产生与高表达Gadd45g、PUMA基因有关,敲除Gadd45g基因后鼻咽癌细胞放射敏感性提高,这可能与改变G1期和S期的细胞周期比例、影响细胞增殖和迁移能力有关。姜黄素可以通过调控PUMA基因逆转鼻咽癌细胞的放射抗拒性,而Gadd45g高表达导致的放射抗拒则不受姜黄素的调控影响。