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纤维素酶水解木质纤维素生物质得到可再生能源,是近年来解决能源紧缺的重要方法。因此针对酶解法中酶成本昂贵和酶解效率低下的问题,本文通过构建里氏木霉EG Ⅱ、EGⅣ、EGV、CBH Ⅰ、CBHⅡ的毕赤酵母重组菌株弥补目前其天然分泌不足;对其性质及在酶解中协同作用进行探讨研究。通过双酶切法和同源重组法构建表达载体pPIC9K-eg2、pPIC9K-eg4、pPIC9K-eg5、pPIC9K-cbh2、pPIC9K-cbh1。电激法分别导入毕赤酵母GS115以构建诱导型毕赤酵母重组子;利用抗性平板初筛与CMC-刚果红平板复筛得到五种重组菌株P.pastoris-eg2-3、P.pastoris-eg4-4、P.pastoris-eg5-6、pastoris-cbh1-12、P.pastoris-cbh2-8。通过摇瓶发酵初步优化,菌株P.pastoris-eg2-3经甲醇诱导168 h,28℃,260 rpm后,EGⅡ酶活力可达 18.5 IU/mL;菌株P.pastoris-eg4-4经甲醇诱导 120h,28℃,260rpm后,EGⅣ酶活力可达4.87 IU/mL;菌株P.pastoris-eg5-6经甲醇诱导168h,28℃,260rpm 后,EGV酶活力达 2.95IU/mL;重组菌株P.pastoris-cbh1-12经甲醇诱导 168h,28℃,240rpm后,CBH Ⅰ酶活力达3.559 IU/mL;重组菌株P.pastoris-cbh2-8经甲醇诱导 168h,26℃,260rpm后,CBHⅡ酶活力达 6.07 IU/mL。纯化后的酶学性质分析显示EGⅡ的最适pH为4.5、最适温度为60℃、Km值约3.6 mg/mL,Vmax值约 241.8 IU/mg;EGⅣ 的最适 pH 为 5.0、最适温度为 60℃、Km 值约 2.4 mg/mL,Vmax值约 156.6 IU/mg;EGV 最适 pH 为 4.5、最适温度为 55℃、Km 值约1.6 mg/mL,Vmax值约 99.7 IU/mg;CBH Ⅰ 的最适 pH 为 5.5、最适温度为 60℃、Km值约 1.8 mg/mL,Vmax值约 116.3 IU/mg;CBHⅡ 的最适 pH 为 5.5、最适温度为 60℃、Km值约 3.1 mg/mL,Vmax值约 214.3 IU/mg。重组酶 EGⅡ/EGⅣ/EGV的分子量约50KDa,专一性地作用于非结晶纤维素;CBH Ⅰ和CBHⅡ的分子量分别约65 KDa、55KDa,能作用于结晶纤维素与非结晶纤维素长链。这都与天然里氏木霉分泌酶的酶学性质相似。通过响应面实验研究得到CBH Ⅰ、CBH Ⅱ、EGⅡ的添加量对酶解效果影响显著。CBH Ⅰ与CBHⅡ之间存在明显协同作用;CBH Ⅰ与EGⅡ、CBH Ⅰ与CBH Ⅰ之间存在不显著协同作用。当重组酶CBHⅠ、CBHⅡ、EGⅡ的添加量分别为总纤维素酶添加量的89.6%、36.6%、20.2%时,与用商业纤维素酶相比,酶解液中葡萄糖含量增加了 9.5%。