研究背景据统计,全球有36%的男性属于吸烟人群,我国的吸烟人口总数已达到3.2亿,且仍在以每年2%的比率增长,在中国每年死于烟草相关疾病的人数近100万。与此同时,不孕不育影响了全世界近10%-15%的夫妇,其中,男性因素约占不孕症病例的40%-50%。多个研究表明香烟中的有害成分会破坏血睾屏障,引起睾丸组织结构的改变,影响精子的发生,最终导致雄性生殖系统的损伤,使男性生育率下降。近年来,氢作为一种新型且安全有效的抗氧化剂具有广泛的应用前景。分子氢副作用小,已经成为抗氧化、抗凋亡等各个领域的研究热点。许多动物研究和临床试验表明氢作为一种小分子物质,它可扩散并穿透细胞膜,发挥广泛的生物学效应,对急性胰腺炎、脓毒血症、呼吸系统疾病、缺血再灌注损伤疾病、自身免疫性疾病、器官移植和多种急、慢性炎症性疾病均可起到治疗和预防作用。分子氢能否发挥香烟暴露引起的雄性生殖系统损伤的防护效应,引起了我们的研究兴趣。香烟暴露引起雄性生殖系统损伤的具体分子机制尚不完全清楚。单细胞转录组测序技术可对单个细胞的全部RNA进行逆转录、扩增和测序,再进行生物信息学分析。本研究利用单细胞转录组测序技术初步探讨香烟暴露对小鼠睾丸生殖细胞的影响和可能的损伤机制。经过前期的实验研究,我们进行了以下探讨。首先,明确香烟暴露对雄性生殖系统的影响,建立香烟暴露引起生殖系统损伤的动物模型。其次,利用分子氢进行损伤干预,明确分子氢对香烟暴露引起的雄性生殖系统损伤的防护作用。最后,利用单细胞转录组测序技术初步探讨香烟暴露对小鼠睾丸生殖细胞的影响和潜在的生物学机制。主要研究内容1、香烟暴露对雄性小鼠一般情况、体重和睾丸重量的影响。2、香烟暴露对雄性小鼠生殖系统的影响。3、分子氢对香烟暴露引起雄性小鼠生殖系统损伤的防护作用。4、小鼠睾丸组织单细胞转录组测序。主要研究方法1、香烟暴露对雄性小鼠一般情况、体重和睾丸重量的影响在整个实验期间密切观察每组小鼠的一般生长状况,比如毛发、饮水、饮食、精神状态、排泄以及活动情况,每3天记录其体重变化,在处死小鼠前再称一次体重,有利于掌握整个实验过程中小鼠的体质量变化。2、香烟暴露对雄性小鼠生殖系统的影响通过HE病理染色、Tunel染色、免疫组化检测PCNA等实验方法,分析香烟暴露对雄性小鼠睾丸组织的具体损伤效应。利用CASA检测雄性小鼠附睾尾精子参数,分析香烟暴露对精子质量参数的影响,并利用精子改良巴氏染色分析香烟暴露引起小鼠精子畸形率的影响。3、分子氢对香烟暴露引起雄性小鼠生殖系统损伤的防护效应通过HE病理染色、Tunel染色、免疫组织化学检测PCNA等实验方法,分析分子氢对香烟暴露引起雄性小鼠睾丸组织的损伤防护效应。利用CASA检测雄性小鼠附睾尾精子参数,分析分子氢对香烟暴露引起精子质量参数降低的防护效应,并利用精子改良巴氏染色分析分子氢对香烟暴露引起小鼠精子形态异常的防护作用。4、利用单细胞转录组测序技术初步探讨香烟暴露对小鼠睾丸生殖细胞的影响和潜在的生物学机制。主要研究结果1、香烟暴露对雄性小鼠一般情况、体重和睾丸重量的影响对照组小鼠体重呈平稳上升趋势,精神状态佳,毛色健康有光泽,饮水、饮食正常,行动敏捷,排泄正常。香烟暴露后小鼠体重下降,精神萎靡,毛色发黄,饮水、饮食较对照组减少,行动迟缓、处死后睾丸重量也较对照组减少。2、香烟暴露对雄性小鼠生殖系统的影响（1）香烟暴露导致小鼠睾丸组织正常病理结构破坏,使睾丸生精小管萎缩退化、生精细胞层数减少、并出现钙化灶。（2）香烟暴露导致小鼠睾丸组织细胞凋亡率增多。（3）香烟暴露在一定程度上导致睾丸组织细胞增殖活力降低,但无统计学意义。（4）香烟暴露导致小鼠附睾尾精子浓度下降、向前运动力及精子总活力降低,但对精子畸形率无显著影响。3、分子氢对香烟暴露引起雄性小鼠生殖系统损伤的防护效应（1）分子氢有效缓解小鼠体重和睾丸重量的下降。（2）分子氢有效减轻香烟暴露后小鼠睾丸组织病理结构损害。（3）分子氢有效减少香烟暴露后小鼠睾丸组织细胞凋亡。（4）分子氢对香烟暴露引起睾丸组织细胞增殖活力的影响无显著作用。（5）分子氢有效缓解香烟暴露引起小鼠精子质量参数的下降,使雄性小鼠精子浓度、向前运动力和总活力得以改善,但对畸形率无显著影响。4、利用单细胞转录组测序技术初步探索香烟暴露对小鼠睾丸生殖细胞的影响和潜在的生物学机制。（1）对新鲜睾丸组织进行单细胞悬液制备及建库后,通过TSNE降维,并根据基因表达情况,通过无监督聚类,进一步划分单细胞群体。基于分群的细胞类型（发育阶段）作出的鉴定结果,可分为10个生殖细胞类型,分别为SSC（精原干细胞）、Diff-ing-SPG（分化中的精原细胞）、Diff-ed-SPG（分化后的精原细胞）、Pre-Leptotene（前细线期）、Leptotene-Zy GOtene（细线-偶线期）、Pachytene（前粗线期）、Diplotene（双线期）、Rs（圆形精子）、Es（长形精子）、Sperm（成熟精子）。（2）利用拟时序分析技术构建细胞间的动态变化轨迹来重塑细胞随着时间的动态变化过程。通过Beam分析选取对照组和香烟暴露组差异最显著的1000个基因,并将这些基因聚类可视化,观察在拟时间过程中各个表达基因模块的变化。并将这些基因分别富集到GO功能分析和Pathway信号通路分析。通过分析发现,在精子发生早期阶段,功能分析及信号通路富集分析显示:香烟暴露所影响的细胞生物学过程主要与细胞周期、DNA损伤刺激的细胞反应、染色质结构、细胞分裂、核糖体生物合成、DNA修复等相关。在精子发生中期阶段,功能分析及信号通路富集分析显示:香烟暴露所影响的细胞生物学过程主要与有丝分裂纺锤体组装、减数分裂姐妹染色单体着丝粒、细胞有丝分裂、精子鞭毛装配、细胞胞质分裂的调节等有关。在精子发生晚期阶段,功能分析及信号通路富集分析显示,香烟暴露所影响的细胞生物学过程主要跟精子鞭毛、纤毛结构和染色质结构相关。（3）通过对精子发生过程早期阶段细胞类型进行GO功能注释和Pathway信号通路分析发现,在精子发生早期阶段,香烟暴露在生精小管发育、精细胞的发育、微管运动、细胞增殖和细胞凋亡等功能上富集较强,并显著影响了Wnt信号通路、MAPK信号通路、细胞周期、丙酮酸代谢等信号通路途径,这些都可能是香烟暴露引起睾丸组织损伤的内在机制。（4）通过Qusage分析发现香烟暴露导致D-精氨酸代谢较对照组降低,这可能是香烟暴露影响精子发生过程的潜在机制。研究结论香烟暴露可导致雄性小鼠体重和睾丸重量减轻,导致睾丸组织病理结构损伤,使睾丸细胞凋亡增多、细胞增殖活力降低,并使精子质量参数下降。分子氢可对香烟暴露所致的生殖细胞损伤进行防护,可减轻香烟暴露引起的睾丸病理结构的破坏,使睾丸细胞凋亡减少,并可一定程度上恢复睾丸细胞增殖活力,对精子质量参数也起到一定的保护作用。对对照组和香烟暴露组小鼠睾丸进行单细胞转录组测序发现,香烟可能通过促进细胞凋亡、影响生精细胞减数分裂过程、抑制生精小管发育、导致DNA损伤、降低精氨酸代谢、影响Wnt信号通路、MAPK信号通路等途径对生殖系统造成损伤,进而影响整个精子发生过程。