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铜绿假单胞菌(又称绿脓杆菌)(Pseudomonasaeruginosa，P．A)为临床常见的条件致病菌，在院内感染中占重要地位，对多种抗生素天然耐药是其特征。近年来，临床上出现了多重耐药铜绿假单胞菌(multi-drugresistantP.aeruginosa)甚至全耐药铜绿假单胞菌(Pan-resistantP.aeruginosa对所有常规监测抗菌药物耐药)¨J。对耐药机制的研究有助于指导临床用药及开发新的有效药物。
本研究观察了多药外排泵抑制剂MC-207¨0(Phe-argβ—naphthyl-amidedihydrochloride)在体外逆转全耐药铜绿假单胞菌对多种抗生素的耐药性；在分子水平对临床分离的全耐药铜绿假单胞菌株中多药外排泵系统的基因表达情况进行了定量分析；对全耐药铜绿假单胞菌株中B一内酰胺酶的产率、型别进行了分析。
第一部分：多药外排泵抑制剂对全耐药绿假单胞菌株耐药性的逆转作用
首先以K-B纸片法观察不同抑制剂浓度(20，40，80[tg／mlMC-20711O)的效果，接着选择20[tg／mlMC-207¨O，观察其对临床分离的全耐药铜绿假单胞菌株耐药性的MIC的改变程度，以初步明确多药外排泵系统作用，同时了解多药外排泵抑制剂MC-207110对其他抗生素MIC的改变情况。结果发现使用泵抑制剂能明显降低环丙沙星(CIP)的MIC，下降倍数为4—8倍，变化率为100％；阿米卡星(AN)有15株MIC发生改变，变化率为40．5％，其中12株下降倍数达8倍；哌拉西林(PIP)有31株MIC发生改变，变化率为84％；下降倍数为4—8倍，头胞孢啶(CAZ)与头孢噻肟(CTX)MIC的变化相近，均有17株，其中15株是相同的，变化率为43％，倍数为8—32倍。
第二部分：SYBRGreenI实时荧光定量RT-PCR检测全耐药绿假单胞菌多药外排泵的mRNA表达
建立以SYBRGreenI实时荧光定量RT-PCR方法检测多药外排泵mRNA表达情况的方法，比较临床分离的全耐药与全敏感铜绿假单胞菌中四种多药外排泵MexAB-OprM、MexCD-OprJ、MexEF-OprN、MexXY-OprM的mRNA表达水平的差异。结果显示与全敏感铜绿假单胞菌相比，全耐药铜绿假单胞菌四种多药外排泵MexAB-OprM、MexCD一0prJ、MexEF—OprN、MexXY-0prM的mRNA的表达水平明显增高(P<0．01)，还存在二种以上的泵同时高表达的情况。
第三部分：全耐药绿假单胞菌株中β一内酰胺酶的检测
首先Nitrocefin试验检测上述菌株是否产生β内酰胺酶；然后选择阳性菌株进行等电聚焦电泳以确定产多少种酶，并初步区分所产酶是那种类型；PCR及PCR产物测序进一步确定β内酰胺酶的种类；采用构建重组质粒转化大肠埃希菌BL21进行克隆表达，再提取质粒后测序以进一步证实部分ESBLs；我们的实验表明在临床全耐药绿假单胞菌株中β一内酰胺酶的含量并不低，36株中34株β一内酰胺酶阳性；检测出3种ESBLs：VEB-3、OXA．10和TEM．¨6，其中VEB-3是最主要的ESBLs类型。