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马齿苋(Portulaca oleracea L.)为马齿苋科一年生肉质草本植物,可药食两用,具有清热解毒、凉血止血、止痢的功效。现代药理研究表明马齿苋具有抗菌、抗炎、镇痛、镇静、抗哮喘、舒张骨骼肌、降血脂、降血糖、抗氧化、抗衰老、神经保护等多方面活性。《本草经疏》言马齿苋“能散肺家之热”,以马齿苋为主药,佐以清热化痰之品,可治疗肺脓肿(肺痈)、肺炎、急慢性支气管炎、化脓性支气管炎、小儿百日咳、肺结核咳嗽、慢性咳嗽等肺系病证属痰热壅肺咳喘者,伊朗传统医药记载马齿苋可治疗哮喘等呼吸系统疾病。此外,临床试验及动物实验表明马齿苋具有抗哮喘作用。上述结果提示马齿苋具有抗哮喘应用基础,并具备发现抗哮喘创新药物的潜力,目前马齿苋平喘作用研究仅局限于水煮液,其激动β2-AR抗哮喘活性成分尚不明确,有待深入研究。一、马齿苋中儿茶酚型四氢异喹啉类生物碱及其衍生物的合成及纯化本课题组前期发现马齿苋中一系列结构新颖的水溶性儿茶酚型异喹啉类生物碱,包括四氢异喹啉类生物碱(Tetrahydroisoquinolines,THIQs),具有不同程度的体外激动β2-AR和抗炎双功能,推测其可能是马齿苋抗哮喘的潜在药效物质基础。然而,由于这些化合物从天然产物中提取分离所得含量通常很低,造成后续体内药理活性研究无法深入展开,化学合成方法成为制备儿茶酚型四氢异喹啉类生物碱的关键手段。本文以盐酸多巴胺和醛为反应底物,采用条件温和的磷酸盐介导的Pictet-Spengler反应合成了马齿苋中儿茶酚型四氢异喹啉生物碱1、2、12及其系列衍生物,共14个化合物(1-14),其中14为新化合物,除产物1、3、4、5、8、12、13外,其余7个生物碱均为首次通过磷酸盐介导的Pictet-Spengler反应仿生合成。由于现存分离纯化方法的局限性,从水溶性反应体系(含磷酸盐、维生素C以及未反应完全的盐酸多巴胺)中大量分离纯化水溶性儿茶酚型THIQs产物成为本实验面临的一个严峻挑战。本实验首次发现利用AB-8大孔吸附树脂柱色谱,首先采用水洗脱可除去磷酸盐和维生素C等水溶性成分,然后采用乙醇洗脱可实现目标THIQs与未反应完全的底物多巴胺的分离,从而制备得到纯化的THIQs。大孔吸附树脂柱色谱法为实现磷酸盐介导的水溶性儿茶酚型THIQs的高效分离纯化提供了一种简便、绿色、环保、通用的新方法。二、马齿苋中儿茶酚型四氢异喹啉类生物碱抗哮喘活性研究本文利用稳定表达α1B-AR、β1-AR和β2-AR的CHO-K1/Gα15中国仓鼠卵巢细胞模型,分别以肾上腺素和异丙肾上腺素作为阳性激动药物,通过钙流检测,考察了马齿苋中儿茶酚型四氢异喹啉类生物碱及本实验合成的衍生物在100 μM时对β2-AR的激动作用及其对α1B-AR、β1-AR和β2-AR的选择性,并探讨了构效关系。首次发现12具有很强的β2-AR激活作用,但其对β1-AR亚型亦具有较好的激动活性;化合物2及本课题组前期制备的马齿苋酰胺E(oleracein E,OE)为选择性β2-AR激动剂,其对α1B-AR、β1-AR的作用弱。在此基础上,本文利用磷酸组胺诱导的豚鼠离体气管螺旋条收缩模型,发现马齿苋中β2-AR激动剂12、2和OE能够剂量依赖性地舒张气管,其解痉百分率的EC50值分别为0.8、2.8和7.0 μM,12、2和OE在低浓度时的气管舒张作用可被β受体阻断剂盐酸普萘洛尔阻断。上述三个化合物按照摩尔比1:1:1混合时在低浓度范围内(0.01 μM～1 μM)可协同止痉,作用强于单个化合物,但在高浓度(大于1 μM)时可能产生竞争性抑制,提示马齿苋抗哮喘作用可能是儿茶酚型异喹啉类生物碱协同作用的结果。本文进一步利用超声雾化组胺诱导的豚鼠化学刺激性急性哮喘气道痉挛模型,发现12在10、20、40 mg/Kg时能剂量依赖性地显著延长豚鼠的引喘潜伏期(p<0.05,p<0.01,p<0.01),而且抽搐跌倒的豚鼠只数呈剂量依赖性下降趋势。2仅在高浓度(40、80 mg/Kg)时能剂量依赖性地显著延长豚鼠的引喘潜伏期(p<0.01),OE仅在高浓度(80、160mg/Kg)时能剂量依赖性地显著降低豚鼠的引喘潜伏期(p<0.05,p<0.01),2和OE对豚鼠抽搐跌倒的只数影响很小或无作用。上述结果表明马齿苋中的儿茶酚型四氢异喹啉类生物碱对组胺喷雾致豚鼠哮喘模型具有抗气道痉挛作用,其作用强弱依次为12>2>OE,与12、2、OE在组胺诱导的豚鼠离体气管螺旋条平滑肌收缩模型中的支气管舒张作用强弱一致。进一步地,本文利用卵白蛋白(OVA)诱导的过敏性哮喘小鼠气道炎症模型,发现12虽然有剂量依赖性降低血液中嗜酸性粒细胞的趋势,但各剂量组与OVA模型组相比均无显著性差异(p>0.05)。12仅在高剂量80 mg/Kg具有抗气道炎症作用,其显著降低了过敏性哮喘小鼠BALF上清液中IL-1β、IL-5、IL-13含量(p<0.05 或p<0.01),分别降低了 34.64%、23.40%、37.63%,但对 BALF 中 TNF-α的含量无显著性影响(p>0.05);中低剂量(5、20mg/Kg)的12无抗炎作用(p>0.05)。三、马齿苋中儿茶酚型四氢异喹啉类生物碱12和2对脂多糖诱导脓毒症小鼠模型的抗炎活性研究本文通过测定血浆中NO、IL-6以及TNF-α以及BALF中IL-6、TNF-α等炎性因子指标,进一步评价了马齿苋中具有平喘作用的儿茶酚型四氢异喹啉类生物碱12、2是否对LPS诱导脓毒症小鼠模型具有抗炎作用。结果表明,单剂量腹腔注射LPS会造成昆明小鼠眼睑分泌物增多、精神萎靡、活动减少,与空白对照组相比,两次造模的脓毒症小鼠模型血浆NO(p<0.05或p<0.0001)、TNF-α(p<0.0001)和 IL-6(p<0.0001)以及 BALF 上清液中 TNF-α(p<0.01)和 IL-6(p<0.01或p<0.05)炎性因子水平均显著升高。各剂量12组对脓毒症小鼠血浆NO的过量释放均无显著影响(p>0.05)。12仅在高剂量80 mg/Kg时显著降低了脓毒症小鼠血浆和 BALF 中 TNF-α(p<0.01,p<0.05)以及 IL-6(p<0.01,p<0.05)的含量,分别降低了 65.16%、56.54%、73.53%和54.75%;但中低剂量的12均无显著影响(p>0.05)。中低剂量的2对脓毒症小鼠血浆和BALF上清液中TNF-α和IL-6的含量均无显著影响(p>0.05),2仅在高剂量(80 mg/Kg)显著降低了血浆和BALF中 TNF-α(p<0.01,p<0.05)以及 IL-6(p<0.05,p<0.05)的含量,分别降低了48.57%、54.62%、46.65%、62.09%。上述结果表明 12 和 2 在 80 mg/Kg 时对 LPS诱导的脓毒症小鼠具有一定抗炎作用。