哺乳动物的呼吸受到中枢神经系统（central nerve system，CNS）内神经元环路的严格调控。与呼吸相关的主要神经核团排列在脑干中，这些核团连续分布并且相互影响，分布于从脑桥到低位脑干的区域。产生呼吸节律和形成呼、吸气节律性运动的中心结构主要位于延髓腹外侧区，包括：包钦复合体（B tzinger complex，B tC）、前包钦复合体（Pre-B tzinger complex， Pre-B tC）和腹侧呼吸组吻侧（Rostral ventral respiratory group，rVRG）。前包钦复合体内神经元具有固有起搏特性，故被认为是正常呼吸节律发生的中心。该核团主要由位于延髓腹外侧区和疑核腹外侧的一群神经元构成的细胞柱组成，被延髓网状结构所包裹。呼吸节律的产生和调控还依赖呼吸环路中各个结构的相互作用和上位脑干，包括脑干吻侧结构、斜方体核、脑桥核团的参与，它们共同控制着呼吸环路的动态特性。最近的观点认为脑干呼吸网络在不同的生理和代谢状态下表现出不同的调节机制。呼吸节律受到多种神经递质的调控，包括兴奋性神经递质和抑制性神经递质。兴奋性神经递质主要是谷氨酸（Glutamate，Glu），它的作用是产生呼吸节律，同时调控呼吸节律向膈肌运动神经元的传递。抑制性神经递质包括γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）和甘氨酸（Glycine，Gly），能够传递抑制性的呼吸信号。除上述提到的经典神经活性物质外，现有的研究结果发现5-羟色胺（5-hydroxtryptamine，5-HT）也参与了呼吸节律的调控，P物质（Substance P，SP）通过增强呼吸节律调节呼吸，而阿片肽类物质则能够抑制呼吸节律。内吗啡肽（Endomorphin，EM）是1997年新发现的一种内源性的阿片肽物质，分为内吗啡肽1（Endomorphin1，EM1）和内吗啡肽2（Endomorphin2，EM2）两种亚型。EM1广泛和密集地分布于大脑和上位脑干，参与痛信息的处理、认知以及应激等功能。EM2主要分布在脊髓和低位脑干，参与痛信息传递的调控以及呼吸抑制等副作用的调节。EM是μ-型阿片受体（μ-opiod receptor，MOR）高选择性和亲和力的配体。EM等阿片肽物质具有强大和高效的镇痛作用以及很多副作用，其中之一就是呼吸抑制，这些副作用极大地限制了它们在临床上作为镇痛药物的应用。为了更好的发挥其强大的镇痛效果，研究并避免其副作用具有重要的临床意义。所以本课题应用现代神经科学研究技术对EM参与呼吸抑制的可能机制进行了以下几方面的研究：1.前包钦复合体内是否存在EM1和EM2的阳性结构？其分布是位于突触前终末还是突触后的树突和胞体内？2.如果EM样阳性结构存在于突触前终末，其来源在哪里？性质是什么？与前包钦复合体内的各类型的神经元是否有突触联系？3. EM在呼吸环路中的作用是什么，是通过什么机制发挥作用，以及与其它神经递质的关系是什么？结果提示：1.我们利用免疫荧光组织化学染色和二氨基联苯胺（3,3’-diaminobenzidine，DAB）染色的方法在前包钦复合体内观察到有大量的EM2样阳性纤维和终末，但是没有EM1样阳性纤维和终末；未见EM1、2阳性神经元胞体的分布。2.应用荧光金（Fluoro-Gold，FG）逆行追踪与EM2免疫荧光组织化学染色相结合的双重标记技术，观察到前包钦复合体内的EM2样阳性终末和纤维主要来源于同侧孤束核（nucleus of the solitary tract，NTS）。统计结果显示在同侧孤束核内，EM2/FG双标神经元占EM2阳性神经元的8%，EM2/FG双标神经元占FG阳性神经元的16.7%。免疫荧光双重染色结果显示EM2样阳性终末和纤维与SP样阳性终末和纤维存在少量双标，与谷氨酸脱羧酶（glutamic aciddecarboxylase， GAD），谷氨酸转运体-2（vesicular glutamate transporter2，VGLUT2）样阳性终末和纤维不存在双标。3. P物质受体（neurokinin-1receptor，NK1R）阳性神经元是前包钦复合体的标志。在激光共聚焦显微镜下免疫荧光多重染色结果显示在前包钦复合体内EM2样阳性纤维与MOR阳性神经元或NK1R阳性神经元发生接触；一部分NK1R阳性神经元同时表达MOR阳性；另外可见EM2样阳性纤维终末与SP-，GAD-，VGLUT2样阳性纤维终末同时和NK1K阳性神经元发生接触，一些EM2样阳性终末与SP样阳性终末存在共存，EM2样阳性终末与GAD或VGLUT2样阳性终末不共存。4.包埋前免疫电镜结果显示EM2样阳性轴突终末内可见DAB产物均匀弥散分布于胞浆内、线粒体外膜及突触小泡外膜上；而MOR和NK1R阳性神经元的胞体或树突内则可见纳米金标记颗粒的存在，呈圆形或者椭圆形黑色颗粒分布于胞体细胞膜或者树突膜下面。EM2样阳性终末与NK1R阳性神经元主要存在对称性的突触联系，对称性的突触结构占突触总数的64%；EM2样阳性终末与MOR阳性神经元也主要存在对称性的突触联系，对称性的突触结构占突触总数的79%。5.鉴于以上形态学研究，我们进一步用机能学的方法对EM2可能的呼吸抑制作用及其机制进行探索。在体膈肌记录结果显示在侧脑室注入EM2能够产生短暂的呼吸抑制，但是同时注入EM2和MOR抑制剂-富纳曲胺（-funaltrexamine，β-FNA）或者D-Pen-Cys-Tyr-D-Trp-Orn-Thr-Pen-Thr-NH2（CTOP）对呼吸没有影响，提示EM2主要是通过作用于MOR发挥呼吸抑制作用。在前包钦复合体注入100μM Tyr-DAla-Gly-MePhe-Gly-ol（DAMGO，0.5μl，单侧）能够降低呼吸的频率和幅度。频率由79.7±1.5breath/min降低为65.5±1.5breath/min （降低17.8±2.1%），幅度由24.9±1.8arbitrary units降低为19.5±1.5arbitrary units（降低21.6±1.4%）。注入β-FNA后没有观察到呼吸频率和幅度的变化。注入10mM EM2（0.5μl，单侧）能够同时抑制呼吸的频率和幅度。频率由84.7±1.7breath/min降低为69±1.9breath/min（降低18.5±2.3%），幅度由25.9±1.8arbitrary units降低为18.5±1.5arbitrary units（降低28.5±1.7%）。预先注入MOR拮抗剂β-FNA能够反转EM2产生的呼吸抑制，进一步证明EM2在前包钦复合体通过MOR发挥呼吸抑制的作用。同时EM2能够加强或者减弱其它神经递质对呼吸频率和幅度的影响。注入2mM SP（0.5μl，单侧）能够增加呼吸的频率和幅度。呼吸频率由80.5±1.2breath/min增加为93.7±2.1breath/min（增加16.4±2.1%），幅度由24.7±1.6arbitrary units增加为33.5±1.7arbitrary units（增加35.6±1.5%），之后给予EM2能够抑制SP产生的呼吸频率和幅度的增加。注入100μM GABA（0.5μl，单侧）能够使呼吸频率由82.5±1.4breath/min降低为57±2.1breath/min （降低30.9±1.6%），幅度则由26.2±1.8arbitraryunits降低为17.3±1.7arbitrary units（降低33.9±1.3%），之后给予EM2则进一步加强GABA产生的呼吸频率和幅度的降低。注入5mM左旋谷氨酸（L-glutamate，L-Glu）后能够使呼吸频率由80.6±1.4breath/min增加为91.4±1.6breath/min（增加13.4±1.9%），幅度由24.4±1.8arbitrary units增加为30.5±1.2arbitrary units （增加25±1.2%），之后给予EM2则减弱L-Glu产生的呼吸频率和幅度的增加。通过以上结果，我们得到如下结论：（1）前包钦复合体内存在EM2样阳性纤维和终末，与MOR阳性神经元存在密切接触。（2）前包钦复合体内的EM2样阳性纤维和终末可能来源于同侧孤束核，可能是肽能的纤维。（3） EM2发挥呼吸抑制的机制可能是作用于前包钦复合体内的MOR阳性神经元。综上所述，孤束核内EM2免疫阳性神经元的胞体发出轴突到达前包钦复合体；在前包钦复合体内，EM2样阳性纤维和终末通过作用于MOR发挥呼吸抑制作用，且该作用很可能是通过突触后抑制而发生的。同时EM2能够加强或者减弱其它神经递质对呼吸频率和幅度的影响，参与呼吸调控。