维生素B6（VitaminB6,VB6）是六种可以相互转化的吡啶衍生物的总称。维生素B6是多种酶的辅酶,在多种物质代谢反应中起重要的作用。磷酸吡哆醛（pyridoxal-5-phosphate,PLP）是维生素B6的主要辅酶活性形式。PLP以辅酶形式参与多种氨基酸代谢转化。PLP的化学结构中存在活泼醛基,在活泼醛基的作用下生物体内的游离PLP会与含有胺基的化合物相结合生成醛亚胺等物质,且这种结合反应极易发生,这就可能影响生物体内含有胺基的化合物或其他物质的正常生理水平。PLP的动态平衡对哺乳动物的正常生理功能的维持有着重要的意义。PLP代谢在哺乳动物体内研究较多,但是对其如何保持动态平衡机制尚不明确。生物体内的PLP水平受到PLP磷酸酶、PL激酶和PNP氧化酶等因素的调控。生物体内游离PLP的浓度需要一定机制进行调控,而PLP的水解是其重要的调控机制。对PLP水解相关酶的基因克隆和分析等方面的研究是明确PLP的水解机制的基础。本研究将大豆作为实验材料,由于大豆种子中含有丰富的植物蛋白,在相应生理过程中氨基酸代谢非常活跃,因此维持体内PLP浓度的动态平衡对大豆有非常重要的意义。本实验以大豆为实验材料,根据在NCBI中查找得到已被命名但未被验证的大豆磷酸吡哆醛磷酸酶（GmPLPP）（Gene ID:100806718）基因,设计引物并克隆,在表达菌株中进行原核表达获得目的蛋白,对目的蛋白进行纯化并研究相关的酶学性质,同时构建GmPLPP的RNAi载体。本研究克隆的大豆GmPLPP基因cDNA长948bp,编码315个氨基酸,对应的分子量约为36.91kDa。核苷酸序列分析结果显示,GmPLPP与人和小鼠特异性PLP磷酸酶的一致性都达到36%。氨基酸序列分析结果显示,GmPLPP的氨基酸序列与人和小鼠特异性PLP磷酸酶的氨基酸序列在与活性位点有关的氨基酸相对保守,同时它们之间含有多个同源的蛋白质翻译后修饰位点（包括1个N-糖基化位点、3个磷酸化位点和3个N-豆蔻酰化位点）。将大豆预测的PLPP基因与已验证的人和小鼠的PLPP基因以及多个物种预测的PLPP基因对比。氨基酸序列的一致性结果显示,多个物种的PLPP基因存在一个与活性位点有关的保守的氨基酸——天冬氨酸;并且发现动物体内PLPP的氨基酸序列之间的一致性较高,植物体内的PLPP氨基酸序列之间的一致性也较高,但是动物之间的PLPP氨基酸序列一致性不高,这可能与植物和动物之间的物种差异性有关。酶学性质分析结果显示,该酶的最适pH约为7.5,最适温度45°C;通过不同二价金属阳离子对酶活性影响研究发现,Mg²⁺对该酶的酶促反应有促进作用,并且能够解除低浓度EDTA对酶促反应的抑制作用;Ca²⁺、Zn²⁺对酶促反应有弱抑制作用;Mn²⁺和Cu²⁺对酶促反应有强抑制作用,这种作用会随其浓度增加而增强。在最适酶促反应条件下,以4-硝基苯磷酸二钠（pNPP）、磷酸吡哆醛（PLP）和磷酸吡哆胺（PMP）为底物的Km值分别为0.608mmol/L、0.452mmol/L和0.637m m ol/L,Vmax分别为0.703umol/min/μg protein、0.814umol/min/μg protein和0.967umol/min/μgprotein。由于PLP的Km值比pNPP和PMP小,说明该酶对PLP的亲和力相对较高。以多种磷酸酯型化合物为底物进行酶活性测定发现,该酶对其他底物也有一定活性,但是对PLP活性是最大的。根据不同化合物对以PLP为底物的酶促反应的影响结果可知,发现咪唑对酶促反应存在竞争抑制作用。并且,pNPP、PMP、Na₃PO₄、Na₂MoO₄、Na₄P₂O₇和KF对酶促反应有抑制作用,并且随浓度升高抑制性增强。本研究已成功构建出GmPLPP的RNAi载体,以便后续研究的进行。