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帕金森病(Parkinson’s disease, PD)是常见的神经系统退行性疾病,其基本的临床症状包括静止性震颤、僵硬、运动迟缓和姿势异常等。由于PD是一种逐渐进展的变性疾病,常导致多种运动障碍,且患病人数逐年增加,因此对社会和经济影响已经越来越大。其主要病理变化是黑质多巴胺(dopamine, DA)能神经元的变性,结果导致纹状体内DA及其代谢产物3,4-二羟基苯乙酸(3,4-dihydroxyphenylacetic acid, DOPAC)含量明显减少。目前治疗PD的主要方法有药物治疗、手术治疗、细胞移植和基因治疗。药物和手术治疗对PD起到缓解症状的作用,不能延缓或阻止疾病进程。细胞移植治疗通过移植细胞替代损失的DA能神经元以恢复黑质多巴胺的神经传递,虽有效果但不持久。目前认为：理想的PD治疗方法应该不仅能纠正脑内DA含量的不足,而且能保护残留的DA能神经元,基因治疗是实现这一目标的最佳途径之一,已成为PD治疗的研究热点。基因治疗通过把目的基因转染到细胞内再进行脑内移植或者通过质粒或病毒载体直接把目的基因转染到脑内病变部位。骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)因来源丰富,取材简便,在体外易于培养和扩增,且自体移植克服了免疫排斥和伦理道德等特点,而成为理想的载体细胞。常用的外源基因主要包括促进DA合成的酶类如酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase, TH)、各种神经营养因子基因及抗凋亡基因等。其中TH是DA合成过程中的限速酶,是神经系统内DA能神经元的蛋白标志。研究发现把外源性的TH基因导入PD模型大鼠纹状体内,可增加脑内DA的水平,改善阿扑吗啡(apomorphine, APO)诱导的旋转症状,对PD有治疗作用。Neurturin(NTN)在结构和功能上与胶质细胞源性神经营养因子(Glial derived neurotrophic factor, GDNF)有关,二者同属于GDNF亚家族,对DA能神经元具有特异性的营养、支持、保护和损伤修复作用。研究证实NTN在体内外都能促进胚胎中脑神经元的存活,阻止神经退行性病变的发生,是治疗PD的种有效的神经保护因子。研究发现将TH或NTN基因修饰的细胞分别移植到PD大鼠脑内,均能明显改善PD大鼠的行为、提高纹状体内DA含量。但进一步研究发现单基因不足以维持DA水平及症状的持续改善,目前研究趋向于多基因共转染的治疗方法；研究发现与单转染TH组相比,将TH与AADC(芳香族氨基酸脱羧酶,DA合成过程中一种重要的酶)共转染PD大鼠纹状体后行为学改变较明显,且不依赖外源性四氢喋呤(BH4),而单转染TH组只有在外源性四氢喋呤(BH4)存在时才可检测到DA。本研究将TH和NTN结合起来进行基因治疗,设想此方法既可增加脑内DA的合成,同时又能保护DA能神经元,二者协同作用以达到双重治疗效果。而目前将TH和NTN双基因共转染BMSCs脑内移植治疗PD的研究国内外尚未见报道。本研究首先利用密度梯度离心法对BMSCs进行体外分离、培养与扩增,研究其生物学特性、增殖情况以及相关特异性抗原的表达,以证实所培养的细胞为BMSCs;随后利用含有两个多克隆位点pIRES质粒,将TH和NTN基因串联起来的,构建TH和NTN双基因表达载体并转染到BMSCs中,获得稳定携带pIRES-TH-NTN的BMSCs,并测定TH-NTN-BMSCs中TH和NTN mRNA和蛋白的表达；最后将TH-NTN-BMSCs移植到PD大鼠纹状体区,观察对PD模型大鼠的治疗作用,并通过多种手段对移植前后PD大鼠行为学、特异性神经递质、组织学以及相关基因与蛋白进行比较分析,为PD的基因治疗探索一种新的有效的方法。本研究分为以下三个部分：第一部分大鼠骨髓间充质干细胞的体外培养及生物学鉴定方法：1.无菌条件下获取大鼠骨髓,密度梯度离心法分离BMSCs,进行原代培养。2. BMSCs传代培养,采用MTT法测定其生长活性。3.利用流式细胞技术和免疫细胞化学染色测定CD34和CD29分子的表达。结果：1.接种后24h内,体积较大的圆型细胞开始贴壁生长：2-3d后细胞大部分贴壁,开始大量伸展；数天后,细胞增殖旺盛,从形态学上判断为BMSCs。2.传代后细胞生长迅速,生长活性测定结果显示随着培养时间的推移,吸光度值逐渐增加,在培养第6-11d时,细胞增殖最为迅速。3.流式检测CD34阳性率仅为2.40%,而CD29阳性率高达93.93％,免疫细胞化学检测CD29呈阳性,CD34呈阴性表达,利用排除法确定培养细胞为BMSCs。第二部分TH-NTN双基因表达载体的构建及体外表达方法：1.利用pMD18T-TH和pcDNA-NTN质粒获取TH和NTN基因,构建pIRES-TH-NTN载体,并进行酶切及基因测序鉴定。2.利用脂质体2000将pIRES-TH-NTN载体转染到BMSCs中,并利用G418进行筛选。3.利用RT-PCR技术检测TH-NTN-BMSCs中TH和NTN mRNA的表达。4.利用酶联免疫吸附法测定转染24h、36h、48h及72h后,TH-NTN-BMSCs中TH和NTN蛋白的表达。结果：1.酶切及基因测序结果表明成功构建pIRES-TH-NTN载体。2.转染及G418筛选后,获得稳定携带pIREs-TH-NTN的BMSCs。3.TH和NTN mRNA在TH-NTN-BMSCs中的表达高于BMSCs。4. TH-NTN-BMSCs中TH和NTN蛋白表达高于BMSCs;第三部分TH-NTN基因修饰的骨髓间充质干细胞对帕金森病模型大鼠的治疗作用方法：1.采用两点注射法,大鼠右侧黑质注射6-羟基多巴胺(6-OHDA)致单侧损毁,制备PD动物模型,大鼠随机分为对照组和模型组。2.术后2、4、6、8w大鼠腹腔注射APO 0.5mg/kg,对模型大鼠进行行为学测试。3.成功模型大鼠分为PD组(未移植组)、BMSCs组(移植BMSCs)和TH-NTN组(移植TH-NTN-BMSCs),利用微量进样器将BMSCs和TH-NTN-BMSCs移植到PD模型大鼠右侧纹状体,移植前对移植细胞进行5-溴脱氧尿嘧啶(BrdU)标记。4.移植2、4、6、8w后对各组大鼠注射APO,并记录30min内旋转圈数。5.采用高效液相-电化学法(HPLC-EC)检测PD组大鼠左右侧及移植后各组大鼠右侧纹状体区组织匀浆液DA及DOPAC含量。6.采用免疫组化法测定PD组大鼠左右侧黑质区TH及移植后各组大鼠右侧纹状体区TH和NTN表达。7.采用RT-PCR和Western blotting测定移植后不同时间点各组大鼠右侧纹状体区TH和NTN mRNA和蛋白含量。结果：1.大鼠右侧黑质注射6-OHDA2w后,开始出现少动、竖毛、行动迟缓,躬身等异常表现,注射APO后,对照组始终无恒定旋转行为,模型组大鼠出现健侧单向旋转行为,连续记录30min的旋转圈数作为PD动物行为学评价指标。旋转圈数超过7r/min视为成功模型,成功模型大鼠达到84只(占73.68%)。2.移植后各组大鼠行为学观察可见,BMSCs组及TH-NTN组大鼠较PD组自主活动增加,TH-NTN组大鼠表现更为明显。APO诱发下2w、4w、6w及8wTH-NTN组较PD组和4w、6w及8w时较BMSCs组30min内旋转圈数显著减少,有统计学意义(P<0.05)3.PD组大鼠右侧纹状体区DA及DOPAC含量较对侧显著降低,其中,8w时DA含量较对侧降低约76.30%,DOPAC含量较对侧降低82.79%。4.2w、4w、6w及8wTH-NTN组较PD组和4w、6w及8w时较BMSCs组大鼠右侧纹状体区DA和DOPAC含量均显著升高,有统计学意义(P<0.05)。5.免疫组化结果显示PD组大鼠损毁侧(右侧)黑质缺乏TH阳性细胞,而对侧存在明显的TH阳性细胞。6.免疫组化结果显示移植后细胞在脑内存活,与BMSCs组相比,TH-NTN组细胞存活时间长。与PD组及BMSCs组相比,TH-NTN组大鼠右侧纹状体区TH和NTN蛋白表达显著增加,有统计学意义(P<0.05)7. RT-PCR和western blotting结果提示与PD组及BMSCs组相比,TH-NTN组大鼠纹状体区TH和NTN mRNA和蛋白含量显著增加,有统计学意义(P<0.05)结论1.密度梯度离心法分离培养大鼠BMSCs,2-3d后细胞大部分贴壁且开始伸展,继续培养后增殖旺盛,其中6～11d增殖趋势明显,流式细胞技术及免疫细胞化学技术显示CD29为阳性,CD34为阴胜,鉴定所培养细胞为BMSCs。2.成功构建pIRES-TH-NTN质粒并转染至BMSCs中,获得稳定携带pIRES-TH-NTN的TH-NTN-BMSCs, TH-NTN-BMSCs中TH和NTN基因大量转录并稳定表达TH和NTN蛋白。3.单侧双点法成功制备大鼠PD模型,将TH-NTN基因修饰后的BMCSs移植到PD大鼠脑内,与BMSCs组相比,细胞存活时间长,大鼠行为功能明显改善,纹状体区TH和NTN的(?)mRNA和蛋白含量显著增加,且DA及其代谢物DOPAC含量明显增加。4.该研究表明将TH和NTN结合起来进行基因治疗,既可增加脑内DA的合成,同时又能保护DA能神经元,二者共同作用达到双重治疗效果,为帕金森病的基因治疗提供了实验依据和新的思路。