全球每年新诊断女性乳腺癌病例超过200万,其中大约62万人死于该疾病,是女性恶性肿瘤中死亡率较高的恶性肿瘤疾病之一。乳腺癌的治疗包括:手术、放疗、化疗、内分泌治疗、分子靶向治疗、免疫治疗等综合性治疗,作为局部治疗手段,手术和放疗对控制乳腺癌的局部复发起到非常重要的作用。其中作为术后辅助治疗和晚期解救治疗措施,放疗可以显著降低乳腺癌的复发风险,进而提高患者的总生存。但是并非所有乳腺肿瘤组织对放射线敏感,辅助放疗后仍有约5-10%近期复发;因此寻找放疗敏感靶点、探寻乳腺癌放射敏感性措施、提高放疗疗效是临床亟待解决的问题。CircRNAs是一种特殊的内源性非编码RNA（ncRNAs）,具有连续的共价环状结构,没有3’端-ploy A尾和5’帽子结构。越来越多的证据表明具有闭环结构的CircRNAs可作为多种肿瘤分子诊断和治疗生物标志物。已有研究证实Circ RNA是恶性肿瘤发生发展过程中重要的调控因子,并与癌症的放射敏感性具有相关性。Hsa＿Circ＿0008500（Circ＿0008500;位置:chr3:196831773-196846401）是一种近年发现的Circ RNA,是乳腺癌中上调最显著的CircRNAs之一,具有良好的诊断价值,但其在乳腺癌放射敏感性和乳腺癌恶化方面研究较少。因此本研究将测定乳腺癌组织和细胞中Circ＿0008500的水平,并探讨hsa-Circ＿0008500在乳腺癌放射敏感性和疾病进展中的作用及机制。第一部分Circ＿0008500抑制乳腺癌细胞系的放疗敏感性并促进乳腺癌细胞生长目的:观察乳腺癌细胞中Circ＿0008500的表达;探讨Circ＿0008500对乳腺癌细胞增殖和放射敏感性的影响。方法:1.使用RT-qPCR方法检测Circ＿0008500在不同分子分型的乳腺癌组织和乳腺癌细胞系中的表达。2.采用琼脂糖凝胶电泳测定,通过哺乳动物基因组DNA提取试剂盒从细胞中分离基因组DNA（g DNA）,使用琼脂糖凝胶电泳、RNase R消化实验等鉴定Circ＿0008500。3.使用细胞转染技术,将构建的特异性针对Circ＿0008500（si-Circ＿0008500;5’-AACCTCTTTCAGGCTTTAATAGA-3’）及其si RNA对照（si-NC）的小干扰RNA（si RNA）转染到MCF-7和MDA-MB-468细胞系中。4.通过RT-qPCR验证si-Circ＿0008500在MCF-7和MDA-MB-468细胞中的敲除效率。5.给予4Gy放射处理后经过细胞集落形成实验、CCK-8测定、Ed U检测,明确肿瘤细胞增殖情况,采用流式细胞技术判定细胞凋亡情况,通过蛋白质免疫印迹试验（Western Blot）测定细胞凋亡相关蛋白BAX蛋白表达和BCL2蛋白的表达水平,判定Circ＿0008500对体外乳腺癌细胞系放疗敏感性的影响。结果:1.Circ＿0008500在乳腺癌组织和乳腺癌细胞系中的表达。与肿瘤旁组织（n=50）相比,乳腺癌组织（n=50）中Circ＿0008500高表达。在亚组分析中与非三阴性乳腺癌（Triple Negative Breast Cancer,TNBC）组织（n=26）相比,Circ＿0008500在三阴性乳腺癌（TNBC,n=24）组织中低表达。Circ＿0008500在ER/PR阳性乳腺癌组织中高表达,而在HER-2阴性和HER-2阳性乳腺癌组织之间表达没有显著性差异。2.体外细胞实验表明Circ＿0008500在乳腺癌细胞系（MCF-7和MDA-MB-468细胞）中的表达高于MCF-10A细胞。3.根据Circ Base2的注释,推测Circ＿0008500来源于DLG1基因的第13-15号外显子,位于chr3:196831773-196846401,合成381个碱基对的环状转录本。琼脂糖凝胶电泳分析结果表明,Circ＿0008500只能使用发散引物的c DNA中扩增,不能从g DNA中扩增。在RNase R处理试验发现DLG1的表达受到RNase R处理的抑制,而Circ＿0008500比DLG1更稳定并且对RNase R具有抗性,确认Circ＿0008500的存在。4.4Gy照射导致MCF-7和MDA-MB-468细胞中Circ＿0008500表达显著降低。5.RT-qPCR的数据表明si-Circ＿0008500在MCF-7和MDA-MB-468细胞系中成功的敲低效率。CCK-8测定表明乳腺癌细胞中Circ＿0008500敲低显著抑制了体外乳腺癌细胞的活力。同时表明敲低Circ＿0008500提高了放射治疗对乳腺癌细胞增殖的抑制作用。6.细胞集落形成试验结果:敲低Circ＿0008500增加放射线对MCF-7和MDA-MB-468细胞集落形成数量的抑制,促进细胞凋亡。7.转染si-Circ＿0008500于MCF-7和MDA-MB-468细胞系中,BAX蛋白表达上调,BCL2蛋白表达下降。结论:1.乳腺癌组织中Circ＿0008500表达高于癌旁癌旁组织;且与组织分化不良相关;2.成功敲低Circ＿0008500后,放疗对MCF-7和MDA-MB-468细胞的抑制率明显增强,促进细胞凋亡。第二部分Circ＿0008500通过miR-758-3p/PFN2轴靶向调控体外乳腺癌细胞增殖与放射敏感性目的:1.观察miR-758-3p在乳腺癌组织及细胞中的表达情况;明确Circ＿0008500中含有miR-758-3p复合物的识别和结合位点;探讨Circ＿0008500通过miR-758-3p的靶向调控机制。2.观察乳腺癌组织和细胞中PFN2表达情况,明确miR-758-3p对其潜在靶点PFN2表达的调控作用,探讨Circ＿0008500调控体外乳腺癌细胞增殖与放射敏感性的下游作用机制。方法:1.Circ＿0008500定位:采用亚细胞定位实验分离细胞的质和核中的RNA,采用RT-qPCR分别检测细胞质和细胞核中的Circ＿0008500表达。2.利用维恩图通过Circ Bank和Circinteractome数据库预测了Circ＿0008500和miR-758-3p之间存在结合位点。3.利用双荧光素酶报告基因和RIP分析来验证Circ＿0008500和miR-758-3p之间存在相互作用,构建WT-Circ＿0008500荧光素酶报告载体。包含miR-758-3p突变靶区的Circ＿0008500的突变片段用于形成突变（MUT）载体（MUT-Circ＿0008500）。将miRNANC或miR-758-3p模拟物与每个报告基因构建体共转染到细胞中。利用Dual-Glo（?）萤光素酶检测系统（Promega）测定每组中萤光素酶的活性,明确Circ＿0008500和miR-758-3p之间存在结合位点及相互作用。4.细胞转染:将针对Circ＿0008500（si-Circ＿0008500;5‘的小干扰si RNA）及其si RNA对照（NC）、micro RNA-758-3p（miR-758-3p）模拟物和对照（miRNANC）和miR-758-3p抑制（miR-758-p抑制剂）及其阴性对照（抑制剂NC）构建体转染到MCF-7和MDA-MB-468细胞中。5.给予4Gy放射处理后经过细胞集落形成实验、CCK-8测定、Ed U检测,明确细胞增殖情况,采用流式细胞技术判定细胞凋亡情况,通过Western Blot测定细胞凋亡相关蛋白BAX蛋白表达和BCL2蛋白的表达水平,观察Circ＿0008500与miR-758-3p靶向调控机制。6.生物信息学分析:利用Starbase数据库预测了miR-758-3p潜在靶基因。利用双荧光素酶报告基因和RIP分析来验证miR-758-3p和PFN2之间存在相互作用,将含有miR-758-3p互补位点的PFN2的野生型（WT）片段单独克隆到p GL3载体中以构建WT-PFN2 3’UTR荧光素酶报告载体。包含miR-758-3p突变靶区的PFN2的突变片段用于形成突变（MUT）载体（MUT-PFN2 3’UTR）。将Mi RNA NC或miR-758-3p模拟物与报告基因构建体共转染到细胞中。使用Dual-Glo（?）萤光素酶检测系统（Promega）测定每组中的萤光素酶活性。7.细胞转染:构建专门针对Circ＿0008500（si-Circ＿0008500）的小干扰RNA（si RNA）及其si RNA对照（si-NC）;miR-758-3p类似物（miR-758-3p mimic）和对照物（miRNA NC）,miR-758-3p抑制剂（miR-758-p抑制剂）及其阴性对照（抑制剂NC）,以及PFN2过表达（pc-PFN2）和阴性对照（pc-NC）。上述质粒和寡核苷酸转染到MCF-7和MDA-MB-468细胞中。8.给予4Gy放射处理后经过细胞集落形成实验、CCK-8测定、Ed U检测,明确细胞增殖情况,采用流式细胞技术判定细胞凋亡情况,通过Western Blot测定细胞凋亡相关蛋白BAX蛋白表达和BCL2蛋白的表达水平以及PFN2蛋白的表达水平,观察miR-758-3p与PFN2靶向调控机制。结果:1.结果表明Circ＿0008500主要富集在细胞质中。2.维恩图显示:Circ Bank和Circinteractome预测了一个重叠的miRNA,Circ Bank预测了Circ＿0008500和miR-758-3p之间的结合位点。3.RT-qPCR分析表明miR-758-3p模拟物在MCF-7和MDA-MB-468细胞中的成功过表达效率。4.双荧光素酶报告基因明确了Circ＿0008500和miR-758-3p之间的相关性。检测结果显示miR-758-3p类似物显著降低WT-Circ＿0008500组的荧光素酶活性,而MUT-Circ＿0008500组的荧光素酶活性不受影响。5.RIP检测显示:抗Ig G组相比,抗Ago2组中Circ＿0008500和miR-758-3p均明显富集。6.数据显示miR-758-3p在乳腺癌组织中显著下调,与非TNBC组织相比,TNBC组织中的miR-758-3p升高,在ER/PR阳性乳腺癌组织中miR-758-3p表达显著降低,但其表达水平与HER-2状态无相关性。7.体外细胞实验表明与MCF-10A细胞相比,MCF-7和MDA-MB-468细胞中的miR-758-3p表达较低。在MCF-7和MDA-MB-468细胞中敲低Circ＿0008500后miR-758-3p的表达上调。8.RT-qPCR数据显示:miR-758-3p抑制剂在MCF-7和MDA-MB-468细胞中显著抑制了miR-758-3p的表达。给予乳腺癌细胞miR-758-3p抑制剂后,显著降低了由于Circ＿0008500缺失而引起的细胞活力受抑制的现象。此外miR-758-3p抑制剂逆转了Circ＿0008500敲低对细胞放射敏感性的增强作用。9.Ed U和细胞集落形成实验表明,miR-758-3p抑制剂显著阻断Circ＿0008500下调对细胞增殖的抑制作用。因此Circ＿0008500敲低促进细胞凋亡,给予miR-758-3p抑制剂后促凋亡作用减弱;同时在MCF-7和MDA-MB-468细胞中,抑制miR-758-3p可逆转Circ＿0008500敲低诱导的Bax蛋白表达上调和Bcl-2蛋白表达下调。10.Starbase预测了miR-758-3p和PFN2之间的潜在结合位点。11.双荧光素酶报告基因分析表明,与MUT-PFN2 3’UTR组相比WT-PFN2 3’UTR组中miR-758-3p模拟物荧光素酶活性显著降低。RIP分析验证了miR-758-3p和PFN2之间的结合位点关系。12.RT-qPCR分析显示与癌旁组织（n=50）相比,PFN2在乳腺癌组织（n=50）中高表达;亚组分析显示:与非TNBC组织相比,TNBC组织中的PFN2表达降低。在ER/PR阳性乳腺癌组织中观察到PFN2表达上调,PFN2的表达与HER-2表达状态无相关性。13.Western Blot显示PFN2的蛋白在乳腺癌组织和乳腺癌细胞系中表达增加。研究表明miR-758-3p模拟物显著抑制了MCF-7和MDA-MB-468细胞中的PFN2蛋白表达。此外Circ＿0008500敲低通过靶向miR-758-3p抑制了PFN2的蛋白质表达。14.Western Blot的结果提示:在转染pc-PFN2的MCF-7和MDA-MB-468细胞中,PFN2的蛋白表达显著上调。在功能上PFN2的过表达显著阻断并抑制了miR-758-3p模拟物诱导的MCF-7和MDA-MB-468的细胞活力和增殖能力。同时PFN2过表达逆转了miR-758-3p模拟物引起的细胞凋亡;使细胞凋亡相关蛋BAX表达减少和BCL2表达增加。结论:1.Circ＿0008500与miR-758-3p之间存在相互作用。2.Circ＿0008500下调通过靶向miR-758-3p抑制乳腺癌细胞的增殖同时增强细胞凋亡。3.PFN2是miR-758-3p的靶点,Circ＿0008500通过靶向miR-758-3p调控PFN2的表达。4.MiR-758-3p通过调节PFN2来抑制乳腺癌细胞的增殖,增强细胞凋亡。第三部分敲低Circ＿0008500抑制乳腺肿瘤组织生长、提高组织放射敏感性的动物实验目的:动物实验验证Circ＿0008500在抑制乳腺肿瘤生长和提高乳腺癌组织放射敏感性的功能及作用机制。方法:1.Cs-137辐照器用于裸鼠肿瘤形成实验中的照射。2.肿瘤形成试验:16只BALB/c裸鼠（4周龄）建立小鼠乳腺癌异种移植模型。实验细胞为:Circ＿0008500敲除细胞;对照组为:MCF-7细胞,实验分为4组,每组4只裸鼠。分组如下:sh-Circ＿0008500组;sh-NC组;sh-NC+辐射组和sh-Circ＿0008500+辐射组。其中辐射组小鼠给与4Gy照射。每周记录肿瘤体积（长×宽~2×0.5）,4周后处死小鼠并检测肿瘤重量和体积。3.免疫组化（IHC）:从异种移植模型小鼠获得的组织切固定后与抗PFN2和二抗孵育。用二氨基联苯胺（DAB）试剂盒染色后,显微镜下观察组织切片PFN2蛋白阳性表达并拍照。结果:1.Circ＿0008500下调或放射治疗均可显著抑制肿瘤体积和重量,与放射治疗组相比sh-circ＿000850转导+放射治疗组肿瘤体积和重量的抑制更为显著。2.小鼠肿瘤的组织中的数据表明Circ＿0008500敲低增强miR-758-3p的表达,并抑制了Circ＿0008500和PFN2的表达。3.Circ＿0008500敲低加重了放射治疗对Circ＿0008500和PFN2表达的抑制作用,以及放射治疗对miR-758-3p表达的促进作用。4.IHC分析表明sh-Circ＿0008500组和放射治疗组的PFN2表达降低,而Circ＿0008500敲低增强了放射治疗对PFN2表达的抑制影响。结论:Circ＿0008500敲低抑制裸鼠体内肿瘤生长,提高了裸鼠体内肿瘤的放射敏感性。