随着生物科技的进步，植物不仅可以为人类提供传统的天然产品，而且已成为表达有医药价值或工业用途的外源蛋白的良好生物反应器，利用植物生物反应器表达外源蛋白，可将外源蛋白富集于种子、块茎、块根等组织器官中，有利于蛋白的分离纯化。由于植物体表达外源蛋白易进行大规模生产，产品获取及加工相对简单，生产成本较低，因此受到人们的广泛重视。但目前将外源基因导入植物的各种方法均有一定的局限性，如操作繁琐费时、外源基因丢失、基因沉默等。因此，开发快速、简便、低成本的外源基因转化方法是研究的重要课题。植物内生菌(endophyte)广泛存在于各种植物组织内，与宿主植物长期互惠共生，人类的植食性食物中均含有内生菌，说明内生菌对人体无害，符合食品安全要求，因此利用转基因内生菌在植物体内表达外源基因可能是一条有效的途径。前人利用工程内生菌在宿主植物中表达的产物主要是抗虫蛋白，而大肠杆菌、巨大芽孢杆菌等原核表达系统的开发则只限于体外培养和表达。为此，本研究从马铃薯（Solanum tuberosum）块茎中分离到一株内生细菌巨大芽孢杆菌Bacillus megateriumPE1，并以此菌株作为外源基因表达菌，将小鼠（Mus musculus）干扰素-γ（interferonγ，IFNγ）基因和家蚕（Bombyx mori）的家蚕素Ⅱ(bombyxinⅡ，BBXⅡ)基因导入Bacillusmegaterium PE1中，进而再回接至马铃薯中，测定了在体外培养及回接到马铃薯植株之后2种外源蛋白的表达情况及表达产物的生理活性。本研究的主要目的旨在探讨使用相对简单的原核生物转化手段，绕过植物转化的过程，利用内生菌实现外源基因在植物中的表达，从而建立一种植物内生菌-宿主植物新型表达系统。主要结果和结论如下:　　(1)对马铃薯块茎中内生菌进行了分离、鉴定与优势菌筛选。首先比较了无菌水冲洗、75％乙醇、0.1％氯化汞以及次氯酸钠几种不同方法对马铃薯块茎进行表面灭菌的效果，确定用次氯酸钠溶液效果最佳。对马铃薯块茎中的内生菌用LB培养基分离、培养，共获得27株内生细菌(编号分别为PE1-PE27)。对各菌株进行16S rDNA测序鉴定，将测序结果于GenBank进行BLAST，利用GenBank上已登录的序列构建系统进化树。经同源性检测，分离到的27个菌株分属于4个属的7个种，其中芽孢杆菌属(Bacillus)共有17株，假单胞菌属（Pseudomonas）有5株，葡萄球菌属(Staphylococcus)有3株，短状杆菌属（Brachybacterium）有2株，芽孢杆菌属的菌株数占总分离菌株数的63.0％,表现出明显的种群优势，而在芽孢杆菌属的17个菌株中，有10株为巨大芽孢杆菌。而且巨大芽孢杆菌作为异源蛋白表达系统已经有良好的研究基础和诸多优势。因此本研究将巨大芽孢杆菌PE1菌株作为表达外源基因的载体菌，定名为“Bacillusmegaterium PE1”。　　(2)研究了溶菌酶浓度、酶解温度及酶解时间对Bacillus megaterium PE1原生质体形成率及再生率的影响。三种影响因素的单因素试验结果表明，三个因素对PE1原生质体形成率的影响与对再生率的影响呈相反趋势。进一步以原生质体形成率与再生率的乘积作为考察指标，针对三个因素设计正交试验以确定最佳的处理条件，结果显示，三种主要因子的影响程度依次为:温度＞时间＞酶量。通过正交试验确定的Bacillusmegaterium PE1原生质体最佳制备条件为:溶菌酶浓度4 mg/mL，酶解温度30℃，酶解时间90 min。　　(3)研究了小鼠干扰素-γ基因(mIFN-γ)导入Bacillus megaterium PE1及其在体外和回接到马铃薯植株中的表达情况。首先克隆了小鼠干扰素-γ基因（mIFN-γ）的cDNA，构建了重组表达质粒pHIS1522-mIFN-γ，以此重组质粒转化Bacillus megateriumPE1，并用D-xylose诱导mIFN-γ的表达，经SDS-PAGE及ELISA检测均表明，mIFN-γ在Bacillus megaterium PE1中获得了表达，表达量为224.6229 mg/L。将表达mIFN-γ的Bacillus megaterium PE1菌株回接到马铃薯组培苗，回接5d、10d、15d、20 d后分别进行检测，均检测到组培苗中有mIFN-γ的存在，说明导入mIFN-γ基因的Bacillusmegaterium PE1菌株能够在马铃薯组培苗中侵染、定殖，并可在马铃薯植株内表达具有活性的外源蛋白。　　(4)研究了家蚕素Ⅱ基因（BBX-Ⅱ）导入Bacillus megaterium PE1及其在体外和回接到马铃薯植株中的表达情况。首先克隆了家蚕素Ⅱ基因(BBX-Ⅱ)的cDNA，构建了重组表达质粒pHIS1522-BBX-Ⅱ，然后转化Bacillus megaterium PE1，筛选携带BBX-Ⅱ的阳性菌落，以D-xylose诱导BBX-Ⅱ的表达，SDS-PAGE检测结果显示，BBXⅡ在Bacillus megaterium PE1中获得了表达。将表达BBXⅡ的Bacillus megaterium PE1菌株回接到马铃薯组培苗，回接5d、10d、15d、20 d后分别进行检测，均检测到组培苗中存在BBXⅡ，说明导入BBX-Ⅱ基因的Bacillus megaterium PE1菌株能够在马铃薯组培苗中侵染、定殖，并可在马铃薯植株内表达BBXⅡ。　　(5)对Bacillus megaterium PE1表达的BBXⅡ进行了纯化和生物活性鉴定。首先将Bacillus megaterium PE1表达的BBXⅡ利用亲和层析获得纯化的BBXⅡ蛋白，配制BBXⅡ注射液，并处理家蚕和小鼠。结果表明，BBXⅡ无论对正常家蚕、饥饿后进食的家蚕还是饲喂高糖饲料诱导的高血糖家蚕，均具有降低血液海藻糖含量及提高海藻糖酶活性的作用。Bacillus megaterium PE1表达的BBXⅡ，对正常小鼠和链脲佐菌素诱导的糖尿病小鼠也均有降血糖的生理活性，其效果与胰岛素相近。　　(6)本研究结果说明，利用马铃薯内生细菌Bacillus megaterium PE1作为外源基因表达菌，无论在体外还是回接到宿主马铃薯植株内，均能表达外源基因，获得具有生物活性的表达产物，因此建立一种植物内生菌-宿主植物新型基因工程表达系统是可能的。这种表达系统具有构建过程相对简单、成本低、内生菌在宿主植物体内扩散快、用量少、通过常规无性繁殖方法可传递给后代、有些内生菌具有多种宿主植物、对人安全无害等诸多优势，如将对人体有益的外源蛋白基因如疫苗、消化道防御性蛋白等导入内生菌并使其在植物中表达，人食用之后可以起到药食两用的效果，将具有良好的开发前景。但对于导入外源基因的内生菌在回接到宿主植物之后与野生菌的竞争与定殖问题、如何提高外源基因的表达量、如何利用宿主植物的蛋白质合成体系对内生菌合成的外源蛋白进行加工修饰，弥补原核表达体系的不足，从而使内生菌在植物中表达外源活性蛋白这一方法成为兼具原核及真核表达体系双重优点等问题还有待于进一步深入研究。