白念珠菌（Candida albicans）是医院获得性真菌病的主要感染源之一，也是深部真菌感染的首要病原菌，引起的致死率可达38％-49%。白念珠菌能适应不同环境变化的能力，尤其是在环境pH的应答过程中获得适应性以及菌株自身发生形态转换的能力对其致病性至关重要，近年来在白念珠菌感染治疗的过程中出现药物耐受性的逐渐上升，获得对药物环境的适应性，在某种程度上也是其发挥致病性的一种保证。白念珠菌逐渐进化出多种复杂的信号途径，借以获得不同的环境适应性，钙细胞存活(Calcium Cell Survival，CCS)途径是酵母细胞中重要的钙信号转导途径，通过Cchl-Midl钙通道引发Ca2+内流并借助钙信号的传递，激活钙调神经磷酸酶(CaN)和Crzlp来介导细胞存活。　　 胞内Ca2+的动态平衡与酵母细胞的pH密切相关，而对外界pH的应答是由保守的RIM101途径所控制，由此推测由Ca2+介导、Crzlp调控的钙信号转导途径和Rim101p调控的RIM101途径协同参与这个应答。然而细胞中Ca2+信号的多样性决定了细胞中必然会有大量的信使和通路的存在，借助于此引发Ca2+浓度的变化。因此研究Crzlp和Riml01p在碱性pH条件下对这些钙通路基因的表达调控，通过构建钙通路基因缺失菌株对白念珠菌Ca2+刺激激活相关的钙通路基因功能的研究，来鉴定经Cchlp-Midlp的Ca2+流入介导的CCS途径在碱性pH压力应答中的重要作用；研究CCS途径对白念珠菌毒力和致病性的调控以及对药物耐受性的影响，将获得这种在医学上极为重要的病原菌是如何利用CCS途径在宿主中存活的依据，本研究所鉴定与识别的药物新靶点也将为临床上白念珠菌感染的介入治疗开辟新的途径。　　 首先，通过荧光定量PCR进行相对定量分析，比较钙通路基因CCH1、MID1、PMR1和YVC1在酸性(pH4)和碱性(pH8)培养条件，以及在酸碱环境分别添加20mmol/L Ca+和5mmol/L EGTA所造成的酸性富钙和碱性缺钙条件下的表达差异，结果表明CCH1和MID1在碱性和酸性富钙的培养条件下表达量较高；碱性低钙条件能够刺激YVC1表达上调；而PMR1在除酸性以外的条件下都有较高表达量，说明CCH1、MID1、YVC1和PMR1均有可能参与在碱性pH应答过程中Ca2+变化的调控。　　 然后，利用二步法PCR介导的基因重组技术构建了白念珠菌钙通路相关基因缺失菌株cchl△/△、midl△/△、yvc△/△、pmrl△/△、cnal△/△和crzlA/△，并通过固体和液体培养方式，确定了Ca2+对碱性pH条件下菌株的生长具有显著影响，在较低Ca2+浓度的碱性环境中(pH8+5mmol/L EGTA+10mmol/L Ca2+)，Cchl和Mid1p在细胞获得Ca2+的过程中起主要作用。　　 利用FLUO-3AM荧光探针负载细胞和流式细胞术结合的方法，追踪碱性pH刺激下白念珠菌细胞内Ca2+浓度的变化以及不同缺失菌株对Ca2+波动变化的影响。结果表明，碱性pH条件能够引起胞内Ca2+浓度的瞬间升高，并且这种变化在cchl△/△和midl△/△缺失菌株中消失；碱性pH刺激下胞内Ca+浓度的瞬间波动变化不是液泡中贮存Ca2+的释放，而主要来源于胞外环境中的Ca2+，由Cchl-Midl介导的胞外Ca2+内流在这个过程中起主要作用；Crzlp和Rim101p也能够对碱性pH刺激下的Ca2+波动变化产生影响。　　 构建嗜热链霉菌（Streptomyces thermophilus）LacZ报告基因与白念珠菌碱性pH应答基因PH089的融合结构(PPHO89-LacZ)，并将其分别转化野生型菌株和缺失菌株cchl△/△、midl△/△、pmrl△/△及yvcl△//，测定结果显示在cchl△/△和midl△/△菌株中，各种培养条件下LacZ活性都明显低于野生型菌株，表明PH089基因启动子的活性是Ca2+依赖性的，通过Cchl-Midl的Ca2+内流对其应答发挥着重要调控作用。将pDDB78-PeHO89-lacZ质粒进一步转化crzl△/△和riml01A/△缺失菌株，确定碱性pH应答基因PH089的启动子活性受到Crzlp和Riml01p的影响，并且Crzlp对启动子活性的调控作用更为明显。　　 荧光定量PCR的结果表明，Crzlp和Riml01p对钙通路基因表达的调控作用是pH依赖性的，在碱性pH条件下，CCH1和MIDl更易受到Crzlp和Riml01p的影响，但Crzlp对其的调控作用是非CaN依赖性的。构建CCH1和MIDl基因启动子与lacZ基因的融合质粒pDDB78-PccH1-lacZ和pDDB78-PMml-lacZ，分别转入野生型菌株和缺失菌株riml01△/△及crzl△/△中，确定在碱性pH条件下，CCH1和MIDl启动子的活性主要受到Crzlp的影响。　　 通过对已克隆得到的lkb的CCH1和MID1基因启动子序列进行分析，发现都存在可能的Crzlp结合位点，分别在CCHl-619位点和MIDl-874位点。电泳迁移率试验(EMSA)证实Crzlp能够与CCH1和MIDI基因启动子内部的结合位点直接结合，并且这种结合作用不受条件影响。利用定点突变分析方法，构建P-619mut和P-874mut两个分别含有CCHl-619和MIDl-874位点突变的启动子序列与LacZ的融合结构，并将其分别转入野生型和crzl△/△菌株中，LacZ测定结果表明，CCHl-619和MIDl-874位点的Crzlp结合序列对于它们各自启动子的活性非常重要，且Crzlp转录激活因子在调控CCH1和MIDl基因的表达方面起着重要作用。　　 通过对固体和液体菌丝发育的诱导、药物平板敏感性试验及倍比梯度稀释法，对CCS途径相关缺失菌株的表型进行分析，结果发现：CCH1和MIDl基因的缺失对白念珠菌菌丝的正常生长有延迟作用，但并不能完全抑制菌丝生成；cchl△/△和midl△/△菌株对50mmolH202和lmmol/L或400μmol/L甲萘醌表现出敏感性，CCH1和MIDl基因的回补都能够弥补缺陷表型；缺失菌株cnal△/△、cchl△//和midl△/△对20℃低温、10mmol/L Fe3+、2%山梨醇和乙醇压力表现出敏感性，但是菌株能够耐受37℃高温，并能够利用2%的半乳糖或是2%的山梨醇作为碳源，这些结果都表明CCS途径在菌丝形态转换和环境适应性的获得方面发挥着重要作用。小鼠系统感染模型的建立及菌落形成单位(CFU)计数分析的结果表明白念珠菌CCH1或MID1基因的缺失在较大程度上减弱了菌株的毒力，表明CCS途径参与了白念珠菌致病性的调控作用。　　 依照M27-A2方案的微量液基稀释法测试野生型和CCS途径缺失菌株对唑类药物的敏感性，结果表明cchl△/△和mid△/△菌株对氟康唑(FLUC)和伊曲康唑(ITRA)均表现出药物敏感性，MIC值与野生型菌株相比明显降低，并接近于敏感菌的MIC值，表明CCS参与了白念珠菌对唑类药物耐受性的调控，并通过对Ca+浓度变化的间接调节来实现。