紫外诱导对圆锥铁线莲次生代谢的影响及其差异蛋白组学研究

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紫外光根据波长范围可分为三种:UV-A(320-400nm)、UV-B(290-320nm)和UV-C(200-290nm),作为一种非生物胁迫因子对地球生物产生了显著的影响,紫外光主要通过影响生物体的DNA、蛋白质合成以及各种信号传导途径而使生物体的生理代谢以及外部形态发生明显变化。地球表面的植被是保持地球生物循环以及生物圈完整性的重要组成部分,植物体表面大多分布有蜡质层、角质层、纤毛以及其它类型的坚硬组织,同时植物体在感受环境胁迫时会调整自身生理及代谢来抵御外界不良因素的影响,因此植物体对于紫外光胁迫的适应能力超过动物及微生物。紫外光能够对植物体产生多方面的影响,如使植株变矮、影响光合作用、影响蛋白质合成等,此外,植物体本身可以产生大量的次生代谢物质来抵御紫外光的损害,这些次生代谢产物多为苯丙素类化合物、生物碱、萜类化合物等,有些次生代谢产物是中药和天然药物活性成分,对于疾病的防治具有重要意义。   蛋白质组学是对生物体或生物体的某种器官、组织、细胞以及相关基因所表达的所有蛋白质进行研究,它涉及到蛋白质的表达、蛋白质的氨基酸序列、蛋白质的结构功能、翻译后修饰以及蛋白质之间的相互作用等内容,是生命科学中与基因组学密切相关的重要研究领域之一。蛋白质在生物体结构组成、生物体的生长、发育、繁殖、代谢等各个环节都发挥着极其重要的作用,也是引起生物多样性的重要因素。随着基因组学的不断发展以及人们对基因组研究的不断深入,科研工作者发现对于生物体内直接行使功能的蛋白及酶的研究将成为继基因组之后的重要的研究领域。   圆锥铁线莲系毛茛科铁线莲属植物,其地上部分在浙江北部地区被广泛用于治疗呼吸系统、泌尿系统炎症以及肿瘤,其含有的主要天然活性成分(次生代谢产物)为黄酮及木脂素类化合物。   本课题对离体的圆锥铁线莲叶片进行不同时间以及不同波长范围的紫外光诱导,通过诱导前后指纹图谱的对比,发现紫外光对圆锥铁线莲次生代谢产物有显著的影响,并对诱导后发生变化的次生代谢产物进行分离纯化以及结构鉴定。通过我们的研究发现,UV-A对圆锥铁线莲新鲜叶片次生代谢的影响并不明显,而在120.83微瓦/平方厘米强度的UV-B下诱导一定时间后,指纹图谱中出现了三个新的色谱峰,以色谱峰的峰面积为指标进行诱导条件的筛选,发现随着UV-B诱导时间的不断延长,三个色谱峰的峰面积有不断增加的趋势,并确定最佳的诱导时间为4-6小时。对圆锥铁线莲新鲜叶片进行大量诱导后烘干,对三个新峰进行追踪分离,采用UV、IR、NMR以及MS对分离得到的三个化合物进行结构鉴定,最终发现UV-B能够诱导圆锥铁线莲产生香豆素类化合物,它们分别是2H,8H-Benzo[1,2-b:5,4-b]dipyran-2-one,10-hydroxy-8,8-dimethyl-(9CI)、4,6,7-三甲氧基-5-甲基香豆素和鲁望橘内酯。   为了揭示紫外光诱导圆锥铁线莲产生香豆素类化合物生物合成的机理,本课题采用双向电泳的方法对诱导前后叶片的差异蛋白进行了研究,通过Image Master5.0软件处理,得到七十三个差异点,通过MALDI-TOF-MS分析对差异蛋白进行鉴定。   综合上述内容,本课题研究的创新之处在于:①通过对照指纹图谱发现了不同波段紫外光对圆锥铁线莲次生代谢的影响,并对诱导后新产生的色谱峰(次生代谢产物)进行了分离纯化和结构鉴定;发现UV-B诱导能够使圆锥铁线莲叶片中产生一系列香豆素类化合物,不仅有简单香豆素,还包括线型吡喃香豆素;②发现UV-B对圆锥铁线莲的影响在诱导八小时之内随着诱导时间的不断延长而变得更加明显;③采用双向电泳技术对圆锥铁线莲紫外诱导前后的差异蛋白质组学进行了研究,最终得到七十三个差异蛋白点,并对差异蛋白进行了质谱鉴定,从蛋白质水平揭示了紫外光对圆锥铁线莲的影响。
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