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目前,CRISPR/Cas9系统凭借Cas9核酸酶的切割活性和向导RNA的靶向能力成为靶向编辑基因的新型技术。而后,核酸酶活性缺失的CRISPR/dCas9系统因其强大的基因调控能力也在慢慢走进人们的视野。CRISPR/dCas9系统通过一小段具有特定碱基序列的单链向导RNA(sgRNA)将dCas9蛋白靶向目标位点,sgRNA与目标位点发生碱基互补配对,同时dCas9蛋白也与靶标DNA链结合。通过将CRISPR/dCas9系统与转录调控因子和表观遗传修饰因子等在内的多种效应因子结合,人们操纵基因组编辑变得更加灵活。CRISPR/dCas9系统能募集效应因子到特定基因组位点,在这一过程中,该系统的可编辑性能和结合能力起到了至关重要的作用。且该系统在基因组上的靶位点选择范围更广泛。将转录调控因子与CRISPR/dCas9系统结合,可以调控基因组中特定基因的表达。在本课题中,采用实验室何苗已建立的利用蛋白相互作用调控基因表达的系统,该系统将dCas9蛋白与一对能相互作用的蛋白对连接,并在蛋白对末端连接一个转录因子蛋白,实现对目的基因的转录调控。而本课题将上述系统中的蛋白对替换成p53和Mdm2蛋白对,使用柔性连接肽将dCas9蛋白与Mdm2蛋白,p53蛋白与具有转录激活功能的VPR连接成融合蛋白,通过Mdm2蛋白与p53蛋白的相互作用,结合起到靶标作用的sgRNA,实现通过蛋白相互作用完成对报告基因红色荧光蛋白的激活。为了验证该系统是通过蛋白相互作用的原理激活报告基因的表达,在体系中加入了破坏蛋白相互作用的特异性小分子抑制剂nutlin-3a,结果该体系的转录激活效率下降,证明该系统确实是通过蛋白相互作用的原理实现对报告基因的激活。本论文主要取得了以下研究成果:(1)成功构建了 dCas9-Mdm2和p53-VPR两种融合蛋白表达载体。(2)将 dCas9-Mdm2,p53-VPR,sgRNA 和 reporter-dtomato 四种质粒转入 293T细胞,在细胞内证明了该系统的转录激活作用。(3)用荧光显微镜和流式细胞仪检测了无nutlin-3a和nutlin-3a浓度逐渐增加的情况下红色荧光蛋白的表达量,并与另一无关小分子抑制剂进行了对照。结果nutlin-3a浓度与红色荧光蛋白的表达量呈负相关,而对照组两者无相关性。说明nutlin-3a能降低该体系的转录激活效率。(4)用荧光定量PCR技术评价了无nutlin-3a和nutlin-3a浓度逐渐增加的情况下红色荧光蛋白mRNA的含量,并与另一无关小分子抑制剂进行了对照。结果nutlin-3a浓度与红色荧光蛋白mRNA的表达量呈负相关,而对照组两者无相关性。进一步证明了 nutlin-3a能降低该体系的转录激活效率。综上所述,本研究成功地建立了通过p53-Mdm2蛋白相互作用实现CRISPR/dCas9转录激活的系统,并且发现该系统的转录激活效率受小分子抑制剂nutlin-3a的调控。