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目的:胃癌是我国最常见的恶性肿瘤之一,近几年发病率呈上升趋势,且发病亦趋于年轻化,而进展期胃癌的综合治疗效果较差,其5年生存率徘徊在30%左右。其难以治愈的原因之一与肿瘤的免疫逃逸有关,抗肿瘤免疫以T细胞介导的细胞免疫为主,T细胞的活化需双信号刺激,其中第二信号由抗原提呈细胞(Antigen-presenting cell,APC)上的共刺激分子与T细胞上的相应配体提供,缺乏第二信号的作用可导致T细胞特异性无应答反应。大量研究证实肿瘤细胞可通过缺乏共刺激分子的方式逃避机体免疫。树突状细胞(Dendritic cell,DC)是体内功能最强大的抗原提呈细胞,能够在体内外诱导并维持初始免疫反应。其功能表现在识别和吞噬病原体,将大分子抗原加工成肽段,刺激未致敏T细胞产生特异性免疫应答。用树突状细胞疫苗治疗肿瘤是当前肿瘤治疗领域的热点之一,在诸多类型的树突状细胞疫苗中更多研究者将目光集中在用全肿瘤信息负载DC,以多个抗原表位的免疫反应,有效地防止由于抗原变异而引起的免疫逃避。4-1BB/4-1BBL是CD28/B7之外的另一对重要的协同刺激信号,4-1BBL属于肿瘤坏死因子(TNF)超家族成员,主要表达于活化的B细胞和T细胞、单核细胞、树突状细胞(DC)、神经母细胞瘤细胞及一些肿瘤细胞上。主要在初次免疫应答的后期起作用,4-1BBL可协同CD28或单独发挥对静止T细胞的活化作用,维持T细胞的生存及免疫记忆应答。本研究将4-1BBL基因导入胃癌细胞,并提取此胃癌细胞总RNA转染树突状细胞制备肿瘤疫苗,并观察疫苗的体外抗肿瘤效应,为胃癌的临床免疫治疗奠定一定的理论基础。方法:1用脂质体法把pMKITneo/4-1BBL基因导入615小鼠前胃癌细胞MFC内,G418进行筛选至长出G418抗性克隆,成为MFC/4-1BBL细胞。2逆转录聚合酶链反应(reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR)鉴定转染细胞中4-1BBL基因mRNA的存在。3自615小鼠骨髓组织中分离树突状细胞(DC),并进行体外培养使之进一步成熟。4用脂质体包裹MFC/4-1BBL细胞总RNA转染小鼠树突状细胞,制备DC/4-1BBL/RNA疫苗。5取615同种异体小鼠脾淋巴细胞,与DC、MFC/4-1BBL/DC混合培养,利用MTT法测各组淋巴细胞增值率。DC、MFC/4-1BBL/DC与小鼠淋巴细胞共培养后刺激T细胞产生特异性CTL细胞,利用MTT法测定肿瘤细胞的杀伤率;ELISA法测定幼稚DC、DC、MFC/4-1BBL/DC培养上清中IL-12的含量及MFC/4-1BBL/DC、DC与T细胞共培养后上清中IFN-γ含量。所有实验数据用SPSS 13.0统计软件处理,P<0.05时认为差异具有显著性。结果:1 4-1BBL基因转染MFC细胞后的鉴定: MFC经脂质体法转染4-1BBL基因、G418筛选后,均获得阳性克隆(MFC/4-1BBL)。提取MFC/4-1BBL细胞总RNA,经RT-PCR可得到616bp的特异性条带,证实有4-1BBL的mRNA较强表达。2树突状细胞的形态学观察:倒置显微镜下观察,培养第3天,细胞数量明显增加,体积增大,部分细胞悬浮生长并聚集成团,呈集落样生长。培养第5天,以悬浮生长为主,体积无明显变化,部分细胞出现足状突起或毛刺状突起,集落明显增多。转染后12h,细胞形态基本恢复至未转染前状态。3 MTT法测定转染前后DC对淋巴细胞的增殖能力:刺激细胞与效应细胞比值分别为1:20、1:10、1:5时各组MFC/4-1BBL/DC对T细胞的增殖作用(0.093±0.012、0.187±0.013、0.187±0.013)均强于相应比值下DC对T细胞的增殖作用(0.060±0.014、0.148±0.017、0.195±0.015);且随刺激细胞与效应细胞比值增高,增值作用逐渐增强。4 MTT法测定转染前后DC激活T细胞杀伤肿瘤的活性:靶细胞与效应细胞比值分别为1:20、1:10、1:5时各组MFC/4-1BBL/DC激活CTL细胞对肿瘤细胞的杀伤率(0.533±0.092、0.321±0.018、0.218±0.025)高于DC激活CTL细胞对肿瘤细胞的杀伤率(0.342±0.023、0.267±0.0243、0.147±0.031),P<0.05;且随效靶比增大,杀伤率逐渐增高。5 ELISA法测定培养液上清中IL-12、IFN-γ的含量: IL-12由多到少依次为MFC/4-1BBL/DC(20.240±2.494 pg/ml)、DC(17.088±3.933 pg/ml)、幼稚DC(10.288±2.390pg/ml),DC明显高于幼稚DC。MFC/4-1BBL/DC (9.451±2.925 pg/ml)与T细胞共培养后上清中IFN-γ含量高于DC组(5.979±1.639 pg/ml)。结论:1 4-1BBL基因应用脂质体法转染后,可以在小鼠胃癌MFC细胞内稳定表达;且应用转染后的MFC细胞的总RNA转染DC后可以得到稳定活性的DC疫苗。2 MFC/4-1BBL/DC对T细胞的增殖作用强于DC;且MFC/4-1BBL/DC培养液上清中IL-12的含量明显高于其余各组。提示此疫苗可提高T细胞增殖能力及机体免疫力。3 MFC/4-1BBL/DC激活肿瘤特异性T细胞对胃癌细胞的杀伤力强于其他组,且MFC/4-1BBL/DC与T细胞共培养后上清中IFN-γ含量高于DC组。提示此疫苗具有较强的抗肿瘤作用。