研究背景与目的人类的妊娠和分娩是极其复杂的生理过程。妊娠子宫平滑肌由静息转变为兴奋收缩状态启动分娩,其具体机制尚不明确,目前仍是临床研究热点之一。孕激素是维持妊娠子宫平滑肌处于静息即舒张状态的重要激素,当孕激素的这种功能被阻断后分娩发生。人类不同于大多数灵长类的是分娩启动时母体血浆孕激素水平并未下降,仍然维持高水平。研究发现孕激素受体(PR)阻断剂,例如RU486,却可以使妊娠子宫收缩导致分娩,于是人们提出了“功能性孕激素撤退”来解释人类和部分灵长类的分娩启动机制。目前研究认为众多“功能性孕激素撤退”的原因中重要因素之一是:孕激素受体亚型(PRs)表达失调,导致子宫对孕激素敏感性降低。PR基因位于11q22-23,含8个外显子,长度大约90kb,主要有PRA、PRB两种亚型。PRA基因是PRB的缩短版,其N端缺少164个氨基酸,PRA、PRB亚型的表达由来自于单个基因转录而来的两个独立的启动子控制,因此PRA和PRB功能不同:PRB作为PR基因全长版本受体,介导孕激素的大多数作用,比如维系子宫处于静息状态,而PRA则抑制PRB此种功能。近期大量研究表明人类妊娠晚期相对于PRB,PRA表达上升,PRA/PRB相对比值上升进而启动分娩,产程开始。然而调节PR亚型发生此种改变的机制尚不清楚。近来有研究发现妊娠晚期子宫平滑肌组织,相比于PRB,PRA启动子区乙酰化水平显著升高,这给表观遗传学调控“孕激素功能性撤退”提供一种可能性。组蛋白乙酰化通过组蛋白乙酰化酶(HATs)和去乙酰化酶(HDACs)改变染色质构象调节基因转录。然而,具体是那些酶作用于PRA基因启动子,使其乙酰化水平升高仍需进一步研究。同时乳腺癌研究中发现HDAC,尤其HDAC1,能与雌激素受体(ERα)启动子结合调节ER表达。真核生物根据序列同源性,HDACs家族分为四大类,主要位于细胞核和细胞质,少部分种类位于细胞器。HDACs家族成员结构和生物学功能各不相同,其中人HDAC1属于Ⅰ类HDACs成员,和酵母Rpd3/Sdi2/Sds6具有同源性。我们前期预实验分析临产孕妇子宫发现伴随着PRA表达升高,HDACsⅠ类成员HDAC1显著下降。结合近期国内外研究,我们推测HDAC1可能参与PR调控,通过表观修饰PR参与分娩发动过程。因此,我们设计实验,展开研究。以期初步探索人类分娩启动的表观遗传相关机制,为早产、过期产的预防和治疗提供依据。1实验方法1.1比较临产组、未临产组孕妇子宫平滑肌组织HDAC1、PRA和PRB的表达,及PRA/PRB值变化。收集临产组和未临产组孕妇子宫平滑肌分别为实验组和对照组,提取组织m RNA和核蛋白,行RT-PCR比较两组标本HDAC1、PRA和PRB的m RNA水平,计算两组标本PRA/PRB值,并western blot检测比较实验组和对照组三种蛋白的表达水平。1.2分离、培养和鉴定原代子宫平滑肌细胞(HUt SMCs)取组织块用胶原酶消化法分离培养原代细胞,并用免疫荧光法和western blot检测人妊娠子宫平滑肌蛋白标志物:Calponin、α-SMA、Vimentin、SM-MHC在培养细胞中的表达。1.3构建HDAC1干扰(HDAC1-RNAi)质粒和HDAC1过表达质粒英俊公司设计和构建沉默HDAC1表达的HDAC1-RNAi质粒和HDAC1过表达质粒。1.4 HDAC1干扰质粒和过表达质粒转染HUt SMCs取P4代HUt SMCs,电穿孔法转染HDAC1干扰质粒、过表达质粒及空载体质粒。流式细胞仪测质粒转染效率。1.5检测沉默HDAC1后HDAC1、PRA和PRB表达变化原代细胞转染干扰质粒后,RT-PCR分析HDAC1、PRA和PRB的m RNA表达变化,及PRA/PRB比值变化,western blot方法检测三个基因的蛋白水平变化。1.6检测过表达HDAC1后HDAC1、PRA和PRB表达变化原代细胞转染过表达粒后,RT-PCR技术和western blot方法分析HDAC1、PRA和PRB的m RNA和蛋白表达变化,及PRA/PRB比值变化。1.7 HDAC1调控PRs的机制研究Ch IP分析比较干扰组、过表组和对照组HDAC1在PRA、PRB启动子区富集量。1.8统计学分析采用Graph Pad Prism5软件行统计学分析。实验数据均先行正态性检验,并以平均值±标准偏差(SD)表示。双尾Student’t检验比较两组间差异。2实验结果2.1比较临产组、未临产组孕妇子宫平滑肌组织HDAC1、PRA和PRB的表达,及PRA/PRB值变化。m RNA水平和蛋白水平分析两组样本:(1)临产组PRA的表达显著高于未临产组;(2)两组间PRB的表达水平无显著统计学差异;(3)临产组PRA/PRB的值明显高于未临产组;(4)临产组HDAC1的水平明显降低,低于未临产组。2.2分离、培养和鉴定原代子宫平滑肌细胞(HUt SMCs)倒置显微镜下观察,样本组织可见典型长梭形肌纤维;原代细胞呈长梭行生长;细胞免疫荧光法和western blot检测发现大量人子宫平滑肌蛋白标志物:Calponin、α-SMA、Vimentin、SM-MHC于原代细胞中的表达。2.3 HDAC1干扰质粒和过表达质粒转染HUt SMCs免疫荧光显微镜及流式细胞仪,见实验组和阴性对照组细胞表达大量绿色荧光,测得质粒转染效率60%以上。2.4检测沉默HDAC1后HDAC1、PRA和PRB表达变化干扰HUt SMCs的HDAC1表达,PRA基因的m RNA和蛋白表达升高;PRB基因未见明显差异。PRA/PRB值升高。2.5检测过表达HDAC1后HDAC1、PRA和PRB表达变化过表达HDAC1,PRA基因的m RNA和蛋白表达降低;PRB基因未见明显差异。PRA/PRB值下降。2.6 HDAC1调控PRs的机制研究CHIP检测发现,干扰组HDAC1在PRA启动子区富集量明显减少;过表达组,其HDAC1在PRA启动子区富集量显著增多。干扰组、过表达组、对照组HDAC1在PRB启动子区富集量无明显变化。3结论1.PRA基因表达升高及PRA/PRB比值升高是产程启动的关键因素之一。2.HDAC1结合于PRA启动子区调控PRA基因表达,而对PRB无显著调控作用。3.HDAC1通过表观遗传修饰调控PRA的表达参与分娩启动机制。