TAG1-APP信号通路在成体神经发生中的作用

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[目的]阿尔茨海默病(AD,俗称老年痴呆)由德国外科医生Alzheimer首次发现,是一种进行性发展、致死性中枢神经系统(central nervesystem,CNS)退退行性疾病。自1906年发现该病至今,其发病机制仍未完全明确,也无精准的早期诊断手段及有效的治疗方法。近年来大量研究证实成年哺乳动物的CNS终身存在着神经发生,这为脑损伤和神经系统变性疾病(如AD)的治疗带来了希望。此外,越来越多的有关衰老和诸如AD等神经系统退行性疾病的研究发现神经发生减少,且与AD发生发展相关的关键分子和信号通路同时影响了神经发生。可见,神经发生能力的减退可能与AD的发病密切相关。本课题组前期研究已经证实TAG1-APP信号通路通过Fe65负性调控胚胎神经源性的脑室区的神经发生,但是在成体神经发生中的作用及其在神经系统变性疾病(如AD)中的作用尚不清楚。据此,本研究将进一步探讨TAG1-APP信号通路对成体神经发生的影响,以期为AD病理机制的理解及探索AD治疗的新靶点提供重要依据。大量文献报道,在成年哺乳类动物脑内,主要在SVZ-RMS-OB系统和海马DG系统存在持续的神经发生。神经干细胞(Neural Stem Cells,NSCs)在这两个系统则主要表达于脑室室管膜下区(subventricularzone,SVZ)和海马齿状回颗粒下区(subgranularzone,SGZ)。这两个脑区的NSCs通过不对称分裂成为定向祖细胞或神经前体细胞(Neural Precusor Cells,NPCs),并逐渐向功能区域迁移,在那里分化为成熟的神经元,并与其它神经元建立突触联系,近而整合入现有的神经网络发挥作用,这一系列的过程称之为神经发生。由于解剖结构的差异,位于SVZ区的NSCs需长距离迁移至功能区域——OB颗粒细胞层,而位于SGZ区的NSCs则短距离即可迁移至功能区域——海马颗粒细胞层,并在它们各自的功能区分化为颗粒细胞,即颗粒神经元。近而分别整合到嗅球(olfactory bulb,OB)及海马的神经元通路中去,可能对脑损伤及AD等神经变性疾病的神经功能的恢复有潜在的治疗作用。据文献报道,SVZ区相较SGZ区能更快速的产生较多的神经元,SVZ区和SGZ区产生的新生神经元对嗅球依赖和海马依赖的学习、记忆有重要作用。神经发生的程度与这两个成体神经发生的关键脑区NSCs和NPCs的增殖、NPCs的迁移和分化及新生神经元的存活密切相关。为延续本课题组前期研究工作,本课题先重点研究SVZ区的成体神经发生,来初步探究TAG1-APP信号通路对成体神经源性的SVZ区新生细胞向神经元分化的作用。另一重要系统的神经发生,将在后续研究中进行。在此,本研究分两部分拟解决如下问题:第一部分 TAG1和APP在成体神经发生的两个关键脑区表达的研究1.用Western Blot方法,检测TAG1和APP在成年小鼠SVZ区及DG区是否有表达?2.用免疫荧光双标的方法,检测TAG1和APP是否在成年小鼠SVZ区及DG区共表达及能否与参与神经发生过程的NSCs和NPCs的标记物共定位?第二部分TAG1-APP信号通路对成体SVZ源性的NSCs和NPCs向神经元分化的研究1.TAG1对成年小鼠SVZ区神经发生是否有影响?2.APP对成年小鼠SVZ区神经发生是否有影响?3.TAG1和APP相互作用对成年小鼠SVZ区神经发生是否有影响?[方法](一)选取8-10周龄的成年C57BL/6J雄性小鼠作为研究对象:1.快速断头取脑,将脑组织放入4℃ HBSS溶液中。用振动切片机冠状切小鼠脑袋,并将脑片收集在4℃ HBSS溶液中。用解剖显微镊于体视显微镜下分离SVZ区和海马齿状回(DG)区的脑组织。采用Western Blot的方法,检测TAG1和APP在成体神经发生的这两个脑区表达情况;2.麻醉灌注后断头取脑,OCT包埋,制作SVZ区和海马DG区冠状连续冰冻切片。每组选取3张非连续切片(按解剖标志保证组间位于相同平面)。采用免疫荧光双标的方法检测TAG1和APP分别在SVZ区和海马DG区的共定位情况,以及TAG1和APP分别与SVZ区和海马DG区的神经干细胞和神经前体细胞标记物(Nestin/GFAP/SOX2/EGFR/PSA-NCAM/DCX)的共定位情况。(二)选取8-10周龄的成年APP基因敲除(APP-KO)小鼠和TAG1基因敲除(TAG1-KO)小鼠及APP和TAG1双敲除(DKO)小鼠与他们同窝的野生型(WT)雄性小鼠作为研究对象:1.采用PCR法进行基因型鉴定,获得APP-KO、TAG1-KO、DKO及同窝WT的雄性实验小鼠;2.按100mg/kg注射剂量,腹腔注射Brdu,每天三次,持续注射两天,并于4周后取材;3.麻醉灌注后断头取脑,OCT包埋,制作嗅球区(OB)区、SVZ区和海马DG区冠状非连续冰冻切片,每张切片放3个非连续脑片,间隔240um。每只老鼠选取5张非连续切片(按解剖标志保证组间位于同一平面)。通过Brdu标记增殖的细胞,NeuN标记成熟神经元。采用免疫荧光双标的方法检测OB区新生神经元(Brdu+ NeuN+)的数量。通过细胞计数,比较基因敲除组与同窝野生型对照组的Brdu+ NeuN+细胞数,分析TAG1-APP信号通路对SVZ区成体神经发生的影响。[结果]1.Western Blot结果显示,TAG1和APP在成体神经发生的两个关键脑区均有表达;2.免疫荧光双标的结果显示,TAG1和APP能共表达于成体神经发生的这两个脑区,且TAG1和APP可分别与SVZ区和海马DG区的NSCs和NPCs的标记物共定位;3.成体SVZ-RMS-OB系统神经发生的结果显示:在OB区,大多数的Brdu+细胞分布在颗粒细胞层(GCL),且大多数能与NeuN+细胞共定位。Brdu+/NeuN+细胞即为从SVZ区迁移到OB的新生神经元。统计结果显示,OB区的新生神经元的数量:TAG1-KO组(152.17±23.48)比同窝 TAG1-WT 组(109.50±23.46)明显增多(P=0.003);APP-KO 组(208.50±57.98)比同窝 APP-WT 组(175.42±31.45)多(P=0.011);TAG1/APP-DKO组(210.14±37.45)比 WT 组(100.59±24.95)多(P=0.028)。[结论]1.TAG1和APP可在成体神经发生的两个关键脑区(SVZ区和DG区)表达并能共表达,且能表达于这两个关键脑区的NSCs和NPCs上;2.TAG1和APP有负性调控成体SVZ区的成体神经发生的趋势;TAG1-APP信号通路主要使SVZ区的新生细胞分化成神经元的数量减少,而抑制神经发生。
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