软骨是组成人体关节和器官的主要成分，由软骨细胞和细胞外基质(蛋白聚糖、Ⅱ型胶原、Ⅸ型胶原和Ⅺ型胶原)构成。软骨相关的常见疾病包括先天性软骨病、外伤和年龄相关的退行性疾病等。由于软骨组织缺乏血管和神经的分布，以及软骨细胞的有丝分裂能力有限，因此软骨组织的自我修复机制受到限制。损伤的软骨组织修复后，会在损伤部位出现一种表达Ⅰ型胶原和Ⅱ型胶原的纤维软骨，从而替代了正常的软骨组织，导致软骨的正常生理功能丧失。传统的临床治疗方法并未取得突破性的进展。自体和异体软骨移植虽然解决了非关节软骨的残损再造，但是有限的软骨来源依然制约这项技术的普及。近年来组织工程技术逐渐被应用于软骨的修复研究，虽然现在仍然处于初始研究阶段，但实验室条件下培养出可以利用的类软骨组织已经成为可能。因此，应用干细胞在治疗软骨损伤领域中取得了很大的关注。被人们所熟知的种子细胞包括人胚胎干细胞（human embryonic stem cells，hESCs）、成体干细胞（adult stem cells，ASCs）和诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPS），但他们自身也存在着各自的缺点：hESCs具有可以在实验室条件下长期培养并维持自我更新的能力，但其形成畸胎瘤的潜在能力限制了它的临床应用；目前关于ASCs的主要研究集中在间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs），由于这一类细胞来源于发育成熟的个体，因此具有随着年龄增长而增殖能力逐渐下降的缺点，因此决定了该类细胞在应用于组织修复时，对组织的修复能力是有限甚至是无作用的；iPS是通过基因转染技术获得的一类可以向多个方向分化的干细胞，但由于受到技术的限制，临床应用时可能出现分化的不统一和畸胎瘤，这在一定程度限制了它的应用。总之，现有的种子细胞和实验方法都不能满足组织工程的需求，因此为了更好的解决软骨的修复问题，我们要寻找一种新的细胞来源和可以定向诱导组织分化的物质。本课题组前期研究表明：N6,2′-O-二丁酰基腺苷3′,5′-环磷酸钠盐（N6,2-O-dibutyryl cyclic adenosine3:5-monophosphate，Bt2cAMP）具有诱导软骨前体细胞向软骨细胞定向分化的能力。因此在本研究中，我们拟通过选取胎龄在8-12周的自然流产胎儿作为胚胎多能干细胞的来源，分别从软骨、羊水和肝组织中获取人胚胎软骨多能干细胞（human embryonic cartilage pluripotent stem cells,hECSCs）、人胚胎羊水多能干细胞（human embryonic amniotic fluid pluripotentstem cells, hEASCs）和人胚胎肝多能干细胞（human embryonic hepatic pluripotentstem cells, hEHSCs）并探讨Bt2cAMP诱导这三种细胞分化为软骨细胞的可能性。为软骨疾病的治疗奠定实验依据。实验结果1.利用胰酶和胶原酶分步消化法，从8-12周自然流产的胎儿关节软骨分离了一种新的干细胞，这种干细胞通过H-DMEM培养基、胎牛血清（fetal bovineserum，FBS）、成纤维细胞生长因子4（Fibroblast growth factor4，FGF4）和白血病抑制因子（Leukaemia Inhibitor Factor，LIF）以及knockout-out培养基和敲除型血清替代物（knockout serum replacement，KSR）的分步骤培养，命名为hECSCs。这种细胞处于胚胎发育的早期，流式细胞仪分析结果提示，它们具有干细胞典型的细胞周期，即细胞大部分停留在G0/G1期，且G0/G1期所占比例经历数次传代降低不显著；表达hESCs标志（OCT4、NANOG、SOX2、SSEA-3和SSEA-4）和ASCs标志（CD29、CD44、CD90、CD73和CD105），不表达hESCs标志（TRA-1-60和TRA-1-81）和人间充质干细胞（human mesenchymal stem cells，hMSCs）标志（CD117和CD271），另外，也不表达移植物抗宿主标志（CD80，CD40和HLA-DR）。2.诱导分化实验证明，通过条件培养基的诱导，hECSCs、hEASCs和hEHSCs可以向脂肪细胞（油红O染色阳性，表达PPARG基因）；成骨细胞（茜素红染色阳性，碱性磷酸酶阳性和表达SPP1基因）；软骨细胞（阿利新兰和甲苯胺蓝染色阳性，免疫组织化学Ⅱ型胶原阳性，实时定量聚合酶链式反应（Real-timeQuantitative PCR，qPCR）检测COL9、COL2A1和SOX9表达升高；胚层相关基因TBX5和MEF2C表达升高；干细胞相关基因OCT4、NANOG和TDGF1表达降低）；神经细胞和胰岛样细胞（RT-PCR和western blot分别检测到NESTIN，NSE和PDX-1，C-peptide的表达）分化。细胞标志和分化潜力的实验都证明这种干细胞是介于hESCs和ASCs之间的一种细胞。3.实验证明Bt2cAMP可以特异性诱导三种人胚胎多能干细胞向软骨细胞分化，并且具有量效依赖关系。Bt2cAMP浓度在1mM时达到最大诱导剂量，使细胞增殖变缓，并出现从成纤维样向铺路石样的细胞形态学改变。形态改变的细胞阿利新兰染色阳性、Ⅱ型胶原免疫组织化学染色阳性以及qPCR也显示软骨相关基因的表达上调和干细胞相关基因的表达下调。揭示着，Bt2cAMP是能诱导具有类似分化能力的干细胞向软骨细胞分化的特异诱导剂。综上所述，1)我们分离了一种新的干细胞，具有hESCs和MSCs的免疫学标志，分化能力和增殖潜能介于hESCs和hASCs之间，命名为hECSCs。2)我们成功确定了Bt2cAMP作为一种诱导剂可以特异性的诱导三种不同组织来源的人胚胎多能干细胞向软骨细胞分化。这些发现都为软骨修复提供了一个新的实验依据。