全世界有190多个国家饲养奶山羊,我国是奶山羊存栏量最多的国家。但我国奶山羊个体的年均奶产量普遍偏低。如何改良奶山羊品种,提高奶山羊的个体产奶量已成为畜牧工作者亟需解决的问题。生长激素(growth hormone, GH)在乳腺发育和泌乳过程中发挥着重要作用。GH不仅可以促进乳腺发育,而且能维持泌乳期乳腺上皮细胞的数量,进而增加奶产量。因此,本研究选用GH作为目的基因,通过体细胞核移植技术培育高产奶量的转基因奶山羊新品种。首先,通过分子克隆技术,利用p-LG基因启动子元件构建能够在乳腺中特异性表达GH的载体pcGH,然后将载体转染到分离培养纯化的乳腺上皮细胞中,验证该载体能在体外分离的乳腺上皮细胞中表达GH；其次,采用电转染的方法将线性化的载体pcGH转染到分离培养的山羊胎儿成纤维细胞中,通过G418药物筛选转GH基因阳性细胞。进一步将转GH基因阳性细胞移植到去核的卵母细胞中,经融合激活待其发育到囊胚或桑椹胚后,移植到代孕母羊子宫中生产F0代克隆奶山羊；再次,通过普通PCR、Southern-blot、荧光定量PCR和TAIL-PCR等技术方法检测了外源基因在FO代克隆羊基因组中的整合情况；最后,为了评估转入的GH基因对奶山羊的影响,对F0代转GH基因奶山羊的生长发育、生理情况、乳腺发育及产奶量等生产性能进行跟踪检测,同时为了评估转GH基因奶山羊羊奶的安全性,将F0代转GH基因奶山羊羊奶饲喂羔羊,跟踪检测小羊的生长发育及生理情况,以期获得高产奶量的转基因奶山羊。主要试验内容分为以下四个部分：1山羊乳腺特异性表达载体pcGH的构建及其验证本部分试验的研究目的是构建能够在山羊乳腺中特异性表达的载体pcGH,并在体外分离培养的山羊乳腺上皮细胞中验证其生物学功能。首先,以萨能奶山羊为材料,从山羊的血液中提取基因组,采用PCR的方法克隆得到包含山羊β-乳球蛋白启动子区、外显子1在内的5’端调控序列(p-LG5)和包含外显子6、7及终止子在内的3’端调控序列(β-LG3),同时利用RT-PCR的方法,从山羊的脑垂体中,克隆得到山羊gh基因；其次,以真核表达载体pV为骨架载体,先将克隆得到的β-LG5基因插入到XhoI位点处,然后再将gh基因插入到β-LG5基因的下游末端EcoRI位点处,再将克隆的β-LG3基因克隆到gh基因的下游末端SalI位点处,构建乳腺特异性表达载体并命名为pcGH。经PCR和酶切验证载体构建正确,且测序结果无碱基突变,说明乳腺特异性表达载体pcGH构建正确。为了验证所构建的载体能够在乳腺上皮细胞中表达,我们通过组织块培养法从泌乳期的乳腺中分离山羊乳腺上皮细胞,并通过差异消化法对乳腺上皮细胞进行纯化,纯化的细胞经免疫组化的方法验证其为上皮细胞；最后,通过脂质体转染的方法,将乳腺特异性表达载体pcGH转染到体外培养的乳腺上皮细胞中。于48 h、60 h、72 h分别收集细胞上清液进行ELISA检测,检测结果表明：转染pcGH到山羊乳腺上皮细胞48 h后,GH表达量极显著高于未转染组(P<0.01),而60 h,72hGH表达量有所下降,但仍显著高于未转染组(P<0.05)。以上结果表明,乳腺特异性表达载体pcGH能在培养的乳腺上皮细胞中表达GH蛋白。这些结果为下一步制备在乳腺中特异性表达GH的转基因奶山羊提供了保障。2转GH基因阳性克隆细胞的筛选及转GH基因奶山羊的制备本部分研究的目的是分离培养山羊胎儿成纤维细胞,转染并筛选转GH基因阳性克隆细胞,同时用激素超排的方法获得卵母细胞,通过体细胞核移植技术制备转GH基因奶山羊。首先,通过组织块培养法,分离培养了山羊胎儿成纤维细胞,PCR方法鉴定分离的山羊胎儿成纤维细胞为雌性。然后使用电转染的方法,将线性化的山羊GH乳腺特异性表达载体pcGH转染到山羊胎儿成纤维细胞中。在转染48 h后,更换培养基添加G418 (500μg/mL)进行抗性筛选,在12 d左右出现明显的克隆团。挑取单克隆细胞团传至48孔板中继续培养,同时将G418浓度减半,待细胞长至80%-90%时,收集细胞,经PCR验证共获得GH阳性细胞65个。饥饿处理后,冻存作为核移植的供体细胞；其次,采用超排处理,从37只供体母羊中共获取卵母细胞388枚,作为核移植的受体细胞；核移植后供融合卵数337枚,融合卵数264枚,融合率为78.34%,激活后获得重构胚254枚。其中115枚重构胚直接移植到受体羊输卵管中,共移植受体羊17只；另138枚重构胚用琼脂包埋,先移植到寄母羊输卵管中,体内培养5 d后,回收胚126枚,其中发育到囊胚期64枚,将胚移植受体母羊子宫中,共移植39只,每只移植1-2枚。合计移植56只受体羊,至35 d检测有26只怀孕。最后,获得6只存活的克隆羊。这些结果为下一步转GH基因奶山羊的鉴定奠定了基础。3转GH基因奶山羊的鉴定本研究的目的是对前期研究获得的F0代转GH基因奶山羊外源基因整合的情况进行鉴定和分析。首先,通过普通PCR和Southern-blot的方法检测,构建的乳腺特异性表达pcGH在F0代转GH基因奶山羊基因组中的整合情况；其次,再通过绝对荧光定量PCR和热不对称交互式PCR (TAIL-PCR)的方法来测定转GH基因拷贝数和整合位点；最后,采用旁侧PCR对获得的整合位点进行验证。PCR和Southern-blot结果表明,所获得的克隆羊均整合有转GH基因构件；荧光定量PCR结果表明：GHcd-2、GHcd-7转GH基因奶山羊的拷贝数分别为12.95±0.18、12.24±1.12。TAIL-PCR检测结果表明：经BLAST比较分析,GHcd-2、GHcd-7两只转GH基因奶山羊外源基因分别整合到基因组3号和11号染色体上。这些结果为转GH基因奶山羊的安全性评价奠定了基础。4转GH基因奶山羊的初步安全性评价本研究的目的是在前期对F0代转GH基因奶山羊的拷贝数及整合位点鉴定的基础上,进一步对转入GH基因的奶山羊自身安全性及转GH基因奶山羊羊奶的安全性进行初步评价。首先,通过对FO代转GH基因奶山羊的生长发育性能进行跟踪观察和测定,研究外源基因对奶山羊自身生长发育性能的影响。结果发现,F0代转GH基因奶山羊的生长发育情况与非转基因奶山羊无显著差异(P>0.05)；通过对FO代转GH基因奶山羊血常规指标、血液生理生化指标进行定期检测,研究外源基因对山羊生理的影响。结果表明,F0代转GH基因奶山羊的各项生理生化指标均在正常范围之内并且与非转基因奶山羊无差别(P>0.05)。而在FO代奶山羊配种后至妊娠后期,转GH基因奶山羊乳围、乳宽及乳头间距等极显著大于非转基因奶山羊(P<0.01)。泌乳初期,转GH基因奶山羊的产奶量显著高于非转基因奶山羊(P<0.05)；而乳成分分析表明,转GH基因奶山羊羊奶的乳成分和非转基因奶山羊羊奶无显著差异(P>0.05)。表明转GH基因奶山羊在增加奶产量的同时,并没有改变羊奶中各乳成分所占的比例。Western-blot检测表明GH在奶中高表达,说明构建的载体能够在乳腺中表达GH蛋白；将F0代转GH基因奶山羊的羊奶饲喂羔羊,检测小羊的生长发育及生理生化指标,结果发现小羊的生长发育及生理并未受到不良影响(P>0.05)。本研究初步获得了泌乳初期产奶量显著增加的转GH基因奶山羊,并对FO代转GH基因奶山羊及其羊奶的安全性进行了初步评估,为今后培育高奶产量的转基因奶山羊提供参考。