目的：克隆广西瑶山亚种树购Toll样受体3 (Toll like receptor 3.TLR3)基因的开放读码框(Open Reading Frame, ORF)序列,进行生物信息学分析。构建广西瑶山亚种树鼩TLR3基因ORF的原核表达载体,原核表达广西瑶山亚种树鼩Toll样受体3重组蛋白。方法：(1)参照滇西亚种TLR3 mRNA预测序列,用Vector NTI分析其ORF,并应用引物设计软件Primer Premier 5.0针对树购TLR3基因序列设计引物,且以广西瑶山亚种树鼩外周血总RNA为模板合成第一链cDNAo (2)设计九条特异性引物进行扩增得到目的片段,与融合表达载体PBET-4连接。将重组质粒PBET-4-TLR3 ORF转入大肠杆菌DH5 α,用含Amp的LB培养基筛出单克隆菌落,菌落PCR鉴定重组克隆分子量大小。(3)送测序,通过基因比对分析广西瑶山亚种树鼩TLR3基因ORF序列和预测滇西亚种树鼩TLR3基因ORF序列的同源性,并对广西瑶山亚种树鼩TLR3基因进行生物信息学分析。(4)提取重组质粒PBET-4-TLR3 ORF,将其转入表达菌株DE3中,用IPTG诱导表达。蛋白变性后,制SDS-PAGE凝胶进行蛋白电泳,考马斯亮蓝染色再脱色,分析广西瑶山亚种树鼩Toll样受体3重组蛋白表达情况。(5)采用DNAMAN软件对克隆得到的广西瑶山亚种树鼩TLR3基因ORF序列进行基因序列分析；用NCBI网站中的BLAST工具对广西瑶山亚种树鼩与其他物种的TLR3基因ORF序列的进行同源性分析。采用Vector NTI软件对广西瑶山亚种树鼩TLR3蛋白的氨基酸序列进行预测,并对广西瑶山亚种树鼩与滇西亚种树鼩的TLR3基因ORF序列和氨基酸序列进行比对；通过软件MEGA 5.10绘制系统进化树；使用(http://web. expasy. org/protscale/)在线软件预测广西瑶山亚种树鼩TLR3蛋白的疏水性；使用(http://smart.embl-heidelberg.de/)在线软件预测广西瑶山亚种树鼩TLR3蛋白的关键结构域；用在线分析工具NetPhos 2.0 Server对广西瑶山亚种树鼩TLR3蛋白的磷酸化位点进行预测。结果：(1)经测序及综合分析表明,构建原核表达载体PBET-4-TLR3 ORF的质粒连接正确,且广西瑶山亚种树鼩TLR3基因ORF序列全长为2757bp, A+T含量为59.15%,C+G含量占40.85%。,编码918个氨基酸；(2)转有PBET-4-TLR3 ORF的DE3表达菌株经IPTG诱导表达后,结果显示广西瑶山亚种树鼩TLR3重组蛋白成功表达,分子大小为125kDa左右,与预期目的蛋白理论值基本符合。广西瑶山亚种树鼩TLR3蛋白分析结果显示：分子量为105.3041kDa,等电点为8.31；疏水性分值在-3.0至4.0之间；该蛋白具有跨膜结构,且有19个关键结构域,其中胞内段为TIR结构,胞外段和胞内段分别有18个和1个关键结构域；还发现它具有37个磷酸化位点,其中含有3个苏氨酸蛋白激酶磷酸化位点、8个络氨酸蛋白激酶磷酸化位点和27个丝氨酸蛋白激酶磷酸化位点。(3)对广西瑶山亚种树鼩TLR3基因ORF序列进行了生物信息学分析,如：基因序列比对显示广西瑶山亚种树鼩与滇西亚种树鼩的TLR3基因序列相似性最高,为98.33%,但仍有差异；与人、黑猩猩、猕猴、狗、猪的相似性次之,为84.75%、84.71%、84.50%、84.48%、84.84%,与啮齿类动物的相似性最低。通过氨基酸序列同源性比对,发现广西瑶山亚种与滇西亚种树鼩TLR3属于同一个类群,与猕猴、黑猩猩和人的距离近,证实广西瑶山亚种树鼩接近于灵长类动物；结论与意义：首次成功克隆广西瑶山亚种树鼩TLR3基因ORF序列,并成功构建原核表达载体PBET-4-TLR3 ORF,诱导其在大肠杆菌BL21(DE3)中获得表达出分子量大小约125kDa左右的特异性条带蛋白。广西瑶山亚种树鼩和滇西亚种树鼩TLR3蛋白有11个氨基酸不同,因此二者TLR3在抗原性方面可能有所不同。本研究为后续广西瑶山亚种树鼩TLR3基因的荧光定量引物设计、多克隆与单克隆抗体制备及功能研究等奠定了基础。