研究背景及目的肝细胞肝癌(Hepatocellular Carcinoma,HCC)是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一,我国每年肝细胞肝癌死亡人数占到全球肝细胞肝癌死亡人数的将近一半。肝细胞肝癌的发生发展错综复杂,具体机制有待进一步研究。我国乙肝患者基数庞大,绝大多数肝细胞肝癌患者携带乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)感染标志。目前而言,肝移植是治疗肝细胞肝癌引起的终末期肝病(End Stage Liver Disease,ESLD)较为有效的手段。尽管器官捐献的数量在逐年上升,但供体数量仍然远远不能满足患者需求。随着生命医学领域的长足进步,肝再生(Liver regeneration)研究不断深入,一方面帮助人们进一步理解肝细胞肝癌的发生发展机制,另一方面帮助人们进一步完善终末期肝病的治疗手段。虽然肝脏在人体内具有极强的再生能力,然而原代肝细胞(Primary hepatocytes,PHCs)却无法在体外长期功能维持与数量扩增,这导致基于肝细胞的细胞治疗和疾病模拟无法顺利开展。寻找肝细胞源成为了亟待解决的问题,科学家们尝试采取多种途径体外获得肝样细胞(Hepatocyte-like cells)。惠利健教授团队等通过异位表达肝脏特异性转录因子(Hepatic specific transcription factors),将成纤维细胞直接转分化为诱导肝样细胞(induced Hepatocyte-like cells,iHeps)或诱导肝前体样细胞(induced Hepatic stem-like cells,iHepSCs),为体外肝细胞的获取提供了一种便捷的方式。然而,该过程涉及外源基因导入,其应用受到遗传变异、致瘤性等限制。为了规避基因插入导致的风险,基于小分子诱导的化学重编程技术(Chemical reprogramming technology)因其在控制细胞命运方面的效率性和安全性,近年来引起了人们的广泛关注。国内外科学家已经实现单纯小分子条件下重编程成纤维细胞为多能干细胞或神经元样细胞,并有文章报道了化学重编程的动态分子机制。消化系统方面,化学重编程也取得了一定的成绩,王韫芳教授团队报道了一种在基质细胞存在条件下逆转胃上皮细胞为诱导内胚层祖细胞(induced Endodermal progenitor cells,iEndoPCs)的方法,上述祖细胞可进一步分化为肝样细胞、胰腺内分泌样细胞和肠上皮样细胞。近期,Ochiya教授团队和本课题组几乎同时报道了一类小分子逆转鼠原代肝细胞为肝前体样细胞的方法,可在体外实现肝细胞大量扩增,并且这种肝细胞来源的肝前体样细胞(Hepatocyte-derived liver progenitor-like cells,HepLPCs)极易肝向分化,为体外肝细胞获取提供了一种全新的思路。尽管如此,目前尚没有针对人原代肝细胞体外扩增与分化的系统研究。综合上述问题,本研究在鼠原代肝细胞成功逆转与扩增前提下,拟进一步研究人原代肝细胞的体外培养体系。本研究的开展将拓宽体外肝细胞来源,为肝病体外模拟及治疗提供新策略,对肝脏再生医学发展和肝癌治疗探索具有重要的科学意义。研究方法1.获取经手术切除的血管瘤旁正常组织分离人原代肝细胞,通过Percoll密度梯度离心和流式细胞仪分选,排除肝脏前体细胞污染;小分子条件培养基体外培养人原代肝细胞,荧光定量PCR等手段研究人原代肝细胞的体外转化;实时成像技术拍摄人原代肝细胞向肝前体样细胞转化过程,记录细胞分裂次数,计算转化效率。2.克隆形成实验观察小分子条件培养基中各个小分子对人原代肝细胞向肝前体样细胞转化的影响;不同时间点细胞计数,绘制HepLPCs的生长曲线,计算倍增时间,EdU实验检测细胞增殖能力;核型分析实验检测不同供者来源的HepLPCs核型稳定性。3.构建肝细胞特异性启动子TBG启动的TBG-EGFP-T2A-puro慢病毒系统,谱系示踪实验观察绿色荧光标记的肝细胞在小分子条件培养基中的转化;记录不同供者来源的HepLPCs传代情况,核型分析实验检测不同代数核型稳定性。4.CCK-8、免疫荧光、荧光定量PCR以及Western Blot等实验研究常用表观遗传调节剂对人原代肝细胞向肝前体样细胞转化的影响;SIRT1选择性抑制剂和SIRT1干扰实验验证SIRT1相关信号通路在上述转化中的作用。5.转录组测序、荧光定量PCR、免疫荧光以及流式细胞技术等分析HepLPCs的表型特征。6.肝向成熟培养基分化HepLPCs,荧光定量PCR、流式细胞技术以及转录组测序等检测肝向分化情况;糖原储存、白蛋白分泌、氨清除以及药物代谢等实验检测肝向分化后的细胞功能;借助FAH基因缺陷联合免疫缺陷小鼠,研究肝向分化后的HepLPCs体内移植修复肝脏及治疗肝衰竭能力。7.HepLPCs低粘附成球培养三维肝向分化后,荧光定量PCR、Western Blot以及免疫荧光等检测HBV感染相关宿主基因表达及翻译情况;HBV病毒感染3D-HepLPCs-Hep细胞球,检测HBV-DNA、HBsAg、HBeAg分泌情况及cccDNA。8.分离HBV感染患者原代肝细胞,小分子条件培养基体外培养,观察HBV感染情况。9.构建靶向cccDNA的CRISPR/CAS9腺病毒,联合恩替卡韦,借助HBV感染的3D-HepLPCs-Hep细胞球模型,进行抗病毒研究。研究结果1.经Percoll密度梯度离心,流式细胞仪分选去除CD24阳性和EpCAM阳性的细胞,获得ASGPR1阳性的人原代肝细胞;人原代肝细胞在小分子条件培养基中肝系标志物逐渐下降,前体相关标志物逐渐升高,大约10天后呈现克隆化生长;细胞培养第2天到第8天实时成像结果显示,约50%的细胞在小分子条件培养基作用下分裂大于2次,实现高效转化。2.各个小分子从条件培养基中依次删减后,克隆形成效率随之降低,说明各因子对转化均有正向影响;HepLPCs倍增时间约为25小时,部分供者来源的细胞在第10代仍然保持旺盛的增殖能力;核型分析结果显示,不同供者来源的HepLPCs具有高度的核型稳定性。3.TBG启动绿色荧光标记的肝细胞在小分子条件培养基中向肝前体样细胞转化并扩增,表面标志物变化情况与上文分选纯化的细胞相似;HepLPCs传代次数存在个体差异,多数集中在10到20代之间,10代以内不同代数间核型具有高度稳定性。4.尼克酰胺促进转化过程中细胞衰老和凋亡,部分通过抑制SIRT1相关信号通路从而影响转化效率;SIRT1选择性抑制剂和SIRT1干扰实验结果均显示,SIRT1抑制影响转化效率,并且在传代过程中整体撤除7个小分子会影响SIRT1相关信号通路进而出现细胞凋亡。5.HepLPCs表达谱水平介于原代肝细胞和胎肝细胞之间,既表达部分肝前体样标志物又表达部分肝系标志物。6.HepLPCs可在1周左右快速肝向分化,聚类结果显示HepLPCs-Hep的肝功能相关基因集接近原代肝细胞,如ABC转运蛋白、胆汁分泌、细胞色素P450等;功能学实验表明,HepLPCs-Hep的糖原储存、白蛋白分泌、氨清除以及药物代谢等能力靠近原代肝细胞;HepLPCs-Hep体内细胞移植后,可重建肝脏并显著缓解模型小鼠肝衰竭状况。7.HepLPCs在低粘附板中形成细胞球,肝向分化后HBV受体基因NTCP显著上调,为后续HBV感染提供基础;3D-HepLPCs-Hep细胞球可被HBV感染,能分泌HBV-DNA、HBsAg、HBeAg,细胞内形成可被检测的cccDNA。8.HBV感染患者来源的原代肝细胞可被小分子条件培养基转化并扩增,扩增状态中存在原有HBV丢失,部分患者来源的HepLPCs三维肝向分化后HBV可再激活。9.CRISPR/CAS9可靶向切割cccDNA,单独使用或者联合恩替卡韦使用都能很好的治疗HBV感染。研究结论本研究在前期工作基础上体外运用小分子条件培养基诱导人原代肝细胞向肝前体样细胞转化并扩增,这种肝细胞来源的肝前体样细胞——HepLPCs增殖迅速且核型稳定。随后鉴定这种体外肝细胞命运转变与SIRT1相关,并且详细描述了HepLPCs的表型特征,建立了HepLPCs的快速肝向分化体系。应用方面,肝向分化后的HepLPCs移植入FAH基因缺陷联合免疫缺陷小鼠体内,可重建其病变肝脏并显著改善肝衰竭症状。HepLPCs三维肝向分化后还可用于HBV感染与抗病毒研究,验证了CRISPR技术靶向切割cccDNA在HBV感染治疗中的作用。本研究拓宽了体外肝细胞来源,为肝病体外模拟及治疗提供了新策略,对肝脏再生医学发展和肝癌治疗探索具有重要的科学意义。