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目的：
食管癌是较常见的恶性肿瘤之一，在世界范围内的所有恶性肿瘤中排名第六位，我国的食管癌患病人数和死亡人数总和约占全球的50%。根据病理类型，食管癌又可分为食管腺癌（Esophageal adenocarcinoma，EAC）和食管鳞状细胞癌（Esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）以及未分化癌症。在中国，约90%的食管癌患者属于ESCC。目前食管癌的治疗方案大概分为：手术切除、放射治疗和化学治疗等，但是这些方法往往具有治愈率低、副作用大等弊端。由于缺乏有效的治疗方法，导致食管癌患者的五年生存率不到20%。因此，从天然化合物中寻找高效、低毒且可用于食管癌化学治疗的药物是非常重要的。
本课题通过细胞毒性实验对多种天然化合物进行筛选，发现6-乙氧基血根碱对ESCC细胞具有细胞毒性，并且对正常食管上皮细胞不具有明显的毒性作用。6-乙氧基血根碱是一种天然化合物，可以从博落回（罂粟科）中提取，属于苯并菲啶生物碱类化合物。目前，尚未有关于6-乙氧基血根碱对ESCC的作用效果及作用机理的报道。本研究首先通过细胞表型实验初步证明了6-乙氧基血根碱可以抑制ESCC细胞的增殖和锚定非依赖性增长，为了探索这种抑制作用的机制，通过磷酸化蛋白质组学分析，发现经过6-乙氧基血根碱处理后可以使细胞中的粘附分子连接(Adherens junction)、真核生物中的核糖体生物发生(Ribosome biogenesis in eukaryotes)、百日咳(Pertussis)、mTOR信号传导途径(mTOR signaling pathway)、RNA降解(RNA degradation)、N-聚糖生物合成途径(N-Glycan biosynthesis pathways)通路下调，并且发现MAPK3Y204和MAPK1Y187的磷酸化水平在这几条通路中出现频次高且明显下调，通过蛋白印迹也验证了这一点，此外还通过Western blotting实验验证了MAPK通路上的p-CRAFS338、p-MEKT394磷酸化水平降低，p-EGFRT693磷酸化水平没有改变，此外，有文献表明激活PI3K/AKT通路可以促进食管鳞癌的发生发展[2,3]，说明PI3K/AKT与食管鳞癌密切相关，经Western blotting实验发现6-乙氧基血根碱处理后的KYSE150细胞中p-PI3KT467，p-AKTS473表达量与对照组相比较呈下降趋势，Western blotting实验发现EGFR可能是一个潜在作用靶点，为了验证这个猜想，首先测试了EGFR激酶活性，与对照组相比较发现6-乙氧基血根碱可以使EGFR激酶活性降低。接着进行了蛋白下拉实验和表面等离子体共振（SPR）实验，实验结果表明6-乙氧基血根碱能够与EGFR结合。更进一步地，通过建立EGFR敲低细胞株，观察当敲低EGFR时，食管鳞癌细胞增殖的改变情况，结果表明，6-乙氧基血根碱处理后的敲低细胞的生存率比野生型ESCC高，6-乙氧基血根碱对敲低EGFR细胞的抑制效果减退，说明EGFR是6-乙氧基血根碱的作用靶点并且可能是一种新型的EGFR抑制剂候选物，可以作为有潜力的食管癌化学预防药物。更深层次地，本课题研究发现6-乙氧基血根碱可以通过体内作用来抑制人源化食管鳞癌移植瘤（Patient-derived xenograft，PDX）模型中SCID小鼠的肿瘤生长。
方法：
1.细胞毒性实验：研究6-乙氧基血根碱对人食管鳞癌细胞KYSE150和KYSE450以及正常食管上皮细胞SHEE的毒性作用。
2.细胞增殖实验：探究6-乙氧基血根碱是否对人食管鳞癌细胞KYSE150和KYSE450以及正常食管上皮细胞SHEE有抑制增殖作用。
3.软琼脂克隆形成实验：探究6-乙氧基血根碱是否对食管鳞癌细胞的软琼脂克隆形成有抑制作用。
4.磷酸化蛋白质组学实验：寻找6-乙氧基血根碱处理KYSE150细胞后引发细胞内磷酸化修饰位点的改变，分析其抑制人食管鳞癌增殖的机制。
5.Western blotting实验：验证6-乙氧基血根碱处理的KYSE150细胞内p-CRAFS338，p-MEKT394，p-ERKT185/Y187，p-ERKT202/Y204，p-EGFRT693，p-PI3KT467，p-AKTS473的磷酸化水平是否发生变化。
6.蛋白下拉实验：研究6-乙氧基血根碱与KYSE150细胞总蛋白中的EGFR是否可以连接。
7.表面等离子体共振实验（SPR）：检测6-乙氧基血根碱与EGFR纯蛋白的结合动力学。
8.检测EGFR激酶活性实验：研究用6-乙氧基血根碱处理食管鳞癌细胞后的EGFR激酶活性是否下降。
9.敲低实验（knockdown）：敲低细胞中的EGFR基因，检测在加入6-乙氧基血根碱后的敲低细胞的存活率与对照相比较是否仍有抑制效果。
10.PDX模型：研究6-乙氧基血根碱在SCID小鼠体内对人食管鳞癌组织的抑制作用。
结果：
1.细胞毒性实验结果显示，浓度为1μM的6-乙氧基血根碱可以使KYSE150和KYSE450细胞的存活率为50%，对SHEE细胞几乎没有毒性作用。
2.细胞增殖实验结果表明，6-乙氧基血根碱浓度在小于1μM时，对KYSE150和KYSE450细胞均有明显的抑制增殖效果，但是对SHEE细胞的增殖作用基本上没有影响。
3.软琼脂克隆形成实验结果显示，6-乙氧基血根碱浓度在1μM时，对KYSE150和KYSE450细胞的锚定非依赖性增长有显著的抑制作用。
4.磷酸化蛋白质组学结果显示，6-乙氧基血根碱能够显著下调细胞中的粘附分子连接、真核生物中的核糖体生物发生、百日咳、mTOR信号传导途径、RNA降解、N-聚糖生物合成途径等通路，并且能抑制这些通路中的ERKY204和ERKY187酸化水平。
5.Western blotting实验结果显示，6-乙氧基血根碱处理的KYSE150细胞中p-CRAFS338、p-MEKT394、p-ERKT185/Y187、p-ERKT202/Y204、p-PI3KT467、p-AKTS473蛋白的磷酸化水平表达明显降低。
6.蛋白下拉实验结果显示，6-乙氧基血根碱能与EGFR连接。
7.SPR实验结果显示，6-乙氧基血根碱与EGFR纯蛋白之间的亲和常数KD值的测定结果为5.263E-4mM，表明6-乙氧基血根碱能有效地与EGFR结合。
8.EGFR激酶活性检测实验结果显示，6-乙氧基血根碱处理组的EGFR激酶活性相比较于对照组显著降低。
9.敲低实验（knockdown）结果显示，敲低EGFR基因的KYSE150和KYSE450细胞，在加入6-乙氧基血根碱后，敲低细胞的存活率比对照细胞高，说明EGFR是6-乙氧基血根碱的作用靶点。
10.PDX模型结果显示，6-乙氧基血根碱给药组的肿瘤体积和重量明显比未处理组低且有统计学意义。
结论：
6-乙氧基血根碱可以通过结合EGFR，抑制MEK/ERK、PI3K/AKT信号通路的活化，从而发挥抑制ESCC细胞增殖的作用。
食管癌是较常见的恶性肿瘤之一，在世界范围内的所有恶性肿瘤中排名第六位，我国的食管癌患病人数和死亡人数总和约占全球的50%。根据病理类型，食管癌又可分为食管腺癌（Esophageal adenocarcinoma，EAC）和食管鳞状细胞癌（Esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）以及未分化癌症。在中国，约90%的食管癌患者属于ESCC。目前食管癌的治疗方案大概分为：手术切除、放射治疗和化学治疗等，但是这些方法往往具有治愈率低、副作用大等弊端。由于缺乏有效的治疗方法，导致食管癌患者的五年生存率不到20%。因此，从天然化合物中寻找高效、低毒且可用于食管癌化学治疗的药物是非常重要的。
本课题通过细胞毒性实验对多种天然化合物进行筛选，发现6-乙氧基血根碱对ESCC细胞具有细胞毒性，并且对正常食管上皮细胞不具有明显的毒性作用。6-乙氧基血根碱是一种天然化合物，可以从博落回（罂粟科）中提取，属于苯并菲啶生物碱类化合物。目前，尚未有关于6-乙氧基血根碱对ESCC的作用效果及作用机理的报道。本研究首先通过细胞表型实验初步证明了6-乙氧基血根碱可以抑制ESCC细胞的增殖和锚定非依赖性增长，为了探索这种抑制作用的机制，通过磷酸化蛋白质组学分析，发现经过6-乙氧基血根碱处理后可以使细胞中的粘附分子连接(Adherens junction)、真核生物中的核糖体生物发生(Ribosome biogenesis in eukaryotes)、百日咳(Pertussis)、mTOR信号传导途径(mTOR signaling pathway)、RNA降解(RNA degradation)、N-聚糖生物合成途径(N-Glycan biosynthesis pathways)通路下调，并且发现MAPK3Y204和MAPK1Y187的磷酸化水平在这几条通路中出现频次高且明显下调，通过蛋白印迹也验证了这一点，此外还通过Western blotting实验验证了MAPK通路上的p-CRAFS338、p-MEKT394磷酸化水平降低，p-EGFRT693磷酸化水平没有改变，此外，有文献表明激活PI3K/AKT通路可以促进食管鳞癌的发生发展[2,3]，说明PI3K/AKT与食管鳞癌密切相关，经Western blotting实验发现6-乙氧基血根碱处理后的KYSE150细胞中p-PI3KT467，p-AKTS473表达量与对照组相比较呈下降趋势，Western blotting实验发现EGFR可能是一个潜在作用靶点，为了验证这个猜想，首先测试了EGFR激酶活性，与对照组相比较发现6-乙氧基血根碱可以使EGFR激酶活性降低。接着进行了蛋白下拉实验和表面等离子体共振（SPR）实验，实验结果表明6-乙氧基血根碱能够与EGFR结合。更进一步地，通过建立EGFR敲低细胞株，观察当敲低EGFR时，食管鳞癌细胞增殖的改变情况，结果表明，6-乙氧基血根碱处理后的敲低细胞的生存率比野生型ESCC高，6-乙氧基血根碱对敲低EGFR细胞的抑制效果减退，说明EGFR是6-乙氧基血根碱的作用靶点并且可能是一种新型的EGFR抑制剂候选物，可以作为有潜力的食管癌化学预防药物。更深层次地，本课题研究发现6-乙氧基血根碱可以通过体内作用来抑制人源化食管鳞癌移植瘤（Patient-derived xenograft，PDX）模型中SCID小鼠的肿瘤生长。
方法：
1.细胞毒性实验：研究6-乙氧基血根碱对人食管鳞癌细胞KYSE150和KYSE450以及正常食管上皮细胞SHEE的毒性作用。
2.细胞增殖实验：探究6-乙氧基血根碱是否对人食管鳞癌细胞KYSE150和KYSE450以及正常食管上皮细胞SHEE有抑制增殖作用。
3.软琼脂克隆形成实验：探究6-乙氧基血根碱是否对食管鳞癌细胞的软琼脂克隆形成有抑制作用。
4.磷酸化蛋白质组学实验：寻找6-乙氧基血根碱处理KYSE150细胞后引发细胞内磷酸化修饰位点的改变，分析其抑制人食管鳞癌增殖的机制。
5.Western blotting实验：验证6-乙氧基血根碱处理的KYSE150细胞内p-CRAFS338，p-MEKT394，p-ERKT185/Y187，p-ERKT202/Y204，p-EGFRT693，p-PI3KT467，p-AKTS473的磷酸化水平是否发生变化。
6.蛋白下拉实验：研究6-乙氧基血根碱与KYSE150细胞总蛋白中的EGFR是否可以连接。
7.表面等离子体共振实验（SPR）：检测6-乙氧基血根碱与EGFR纯蛋白的结合动力学。
8.检测EGFR激酶活性实验：研究用6-乙氧基血根碱处理食管鳞癌细胞后的EGFR激酶活性是否下降。
9.敲低实验（knockdown）：敲低细胞中的EGFR基因，检测在加入6-乙氧基血根碱后的敲低细胞的存活率与对照相比较是否仍有抑制效果。
10.PDX模型：研究6-乙氧基血根碱在SCID小鼠体内对人食管鳞癌组织的抑制作用。
结果：
1.细胞毒性实验结果显示，浓度为1μM的6-乙氧基血根碱可以使KYSE150和KYSE450细胞的存活率为50%，对SHEE细胞几乎没有毒性作用。
2.细胞增殖实验结果表明，6-乙氧基血根碱浓度在小于1μM时，对KYSE150和KYSE450细胞均有明显的抑制增殖效果，但是对SHEE细胞的增殖作用基本上没有影响。
3.软琼脂克隆形成实验结果显示，6-乙氧基血根碱浓度在1μM时，对KYSE150和KYSE450细胞的锚定非依赖性增长有显著的抑制作用。
4.磷酸化蛋白质组学结果显示，6-乙氧基血根碱能够显著下调细胞中的粘附分子连接、真核生物中的核糖体生物发生、百日咳、mTOR信号传导途径、RNA降解、N-聚糖生物合成途径等通路，并且能抑制这些通路中的ERKY204和ERKY187酸化水平。
5.Western blotting实验结果显示，6-乙氧基血根碱处理的KYSE150细胞中p-CRAFS338、p-MEKT394、p-ERKT185/Y187、p-ERKT202/Y204、p-PI3KT467、p-AKTS473蛋白的磷酸化水平表达明显降低。
6.蛋白下拉实验结果显示，6-乙氧基血根碱能与EGFR连接。
7.SPR实验结果显示，6-乙氧基血根碱与EGFR纯蛋白之间的亲和常数KD值的测定结果为5.263E-4mM，表明6-乙氧基血根碱能有效地与EGFR结合。
8.EGFR激酶活性检测实验结果显示，6-乙氧基血根碱处理组的EGFR激酶活性相比较于对照组显著降低。
9.敲低实验（knockdown）结果显示，敲低EGFR基因的KYSE150和KYSE450细胞，在加入6-乙氧基血根碱后，敲低细胞的存活率比对照细胞高，说明EGFR是6-乙氧基血根碱的作用靶点。
10.PDX模型结果显示，6-乙氧基血根碱给药组的肿瘤体积和重量明显比未处理组低且有统计学意义。
结论：
6-乙氧基血根碱可以通过结合EGFR，抑制MEK/ERK、PI3K/AKT信号通路的活化，从而发挥抑制ESCC细胞增殖的作用。