产河豚毒素微生物的研究

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1、从河豚鱼的卵巢中分离出35株野生菌,其中15株菌株遗传性状稳定。用小鼠生物检测法对15株菌株的发酵产物进行了检测,初筛选出11菌株进行复筛,结果有6株菌毒素含量均在400ng/ml,其中菌株B-333毒素含量最高为489.40ng/ml,因此选择菌株B-333作为出发菌株,并命名为ZY-23。2、通过对ZY-23菌株的形态特征、培养特征、生理生化特征进行了研究与分析。结果表明,ZY-23菌株具有沙雷氏菌的典型的形态特征和生理生化特征。该菌株最适生长温度26℃,最适pH7.0,最适Nacl浓度2%。3、通过提取ZY-23菌株的基因组DNA,利用16S rRNA基因通用引物,进行扩增、转化感受态大肠杆菌,将阳性克隆测序,获得ZY-23菌株的16S rRNA基因序列,构建进化树,证实ZY-23菌株与Serratia sp.Tp5有99%的同源性。4、通过小鼠生物法测定发酵离心液和破壁后的菌体细胞上清液,结果表明发酵离心液中含有毒性成分,破壁后的细胞上清液不含毒性成分,ZY-23产生的毒素为胞外产物。采用荧光分光光度计对发酵离心液进行测定,结果在423nm处标准品与ZY-23提取物都有相同的发射峰,初步证实发酵液含有河豚毒素。5、通过研究确定了高效液相检测法测定TTX的条件:流动相乙腈:水15:85,流速0.5ml/min,检测波长191nm,柱温23℃,进样量:20ul。HPLC检测结果显示,ZY-23菌株的发酵产物中提取得到的毒性成份保留时间与标准品基本一致。初步证实菌株ZY-23的发酵产物为河豚毒素或河豚毒素衍生物。
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