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甘露聚糖酶是一类重要的半纤维素酶,可以广泛应用于饲料、食品、石油开采以及洗涤行业中。为获得性质优良的甘露聚糖酶,本研究在筛选新的甘露聚糖酶的同时,也对现有的甘露聚糖酶进行热稳定性改造,以满足工业生产的需求。从Talaromyces leycettanus JCM12802,Gloeophyllum trabeum CBS900.73,Staphylotrichum coccosporum NBRC 31817和Alternaria sp.四株真菌中克隆得到五个糖苷水解酶第5家族的甘露聚糖酶基因(man5A,man5B,man5D,man5DB和man5DW)和一个第26家族的甘露聚糖酶基因(man26DW),均在毕赤酵母中成功表达。其中来源于T.leycettanus JCM12802的Man5A是目前报道的作用温度最高的真菌来源的内切β-甘露聚糖酶,最适温度为90°C,在70°C处理1 h仍能保持稳定,其最适p H为4.5,在p H 3.0?10.0范围内能保持稳定,并且能够有效降解带有不同侧链的甘露聚糖。来源于G.trabeum CBS900.73的Man5B的最适p H为2.5,属于极端嗜酸的甘露聚糖酶,在p H 2.0?6.0能发挥80%以上的活力,在p H 2.0?10.0处理1 h能保持80%以上的酶活,而且Man5B还具有较强的胃蛋白酶和胰蛋白酶抗性。在动物的模拟胃肠道实验中,Man5B对干物质的消化程度要高于商业酶。另外,Man5B优异的底物降解能力和转糖苷活性,使其可以应用于食品行业中的甘露寡糖制造。来源于S.coccosporum NBRC 31817的Man5D和Man5DB,以及来源于Alternaria sp.的Man5DW和Man26DW的最适p H为5.0?6.0。Man26DW的最适温度为50°C,其余三者皆在65?70°C之间。上述四个甘露聚糖酶能够抵抗多数金属离子和化学试剂的作用,能够较大程度降解含有不同侧链的聚糖,而且具有转糖苷作用,因此也可用于天然甘露寡糖的制备。为研究甘露聚糖酶的嗜热机制,本研究将嗜热甘露聚糖酶Man5A与第5家族其它具有不同作用温度的甘露聚糖酶进行多序列比对以及结构模拟,结果发现Man5A具有一个可能与热稳定性相关的CBM结构域和两个独特的氨基酸(Asp191和Arg286)。因此构建了一个截短酶Man5A?CBD和一个突变体D191G/R286H,并成功在毕赤酵母中表达。结果表明截短酶Man5A?CBD和突变体D191G/R286H的热稳定性均比原酶差,由此确定该CBM结构域和两个氨基酸影响Man5A的热稳定性。初步研究了Bispora sp.MEY-1来源的Bman的糖基化修饰对其热稳定性的影响,根据预测的七个糖基化位点构建了15个突变体,发现绝大部分突变体的热稳定性均有所提高。初步推测糖基化修饰对热稳定性的影响与糖基化位点的位置相关,而与糖基化位点的数目无关。但是具体原因还需要进一步的研究分析。本研究通过基因克隆的方法获得了六个新的甘露聚糖酶基因并实现了外源高效表达,同时通过定点突变和截短实验对影响甘露聚糖酶热稳定性的因素进行了初步研究。本研究不仅丰富了甘露聚糖酶的基因资源,提供了六个性质优良的工业候选酶,而且发现了两个与甘露聚糖酶热稳定性相关的因素,为甘露聚糖酶的热稳定性改良提供了理论依据。