在自然界中,纤维素生物质是生物圈中最丰富的有机成分,其微生物介导的降解是全球碳循环的一个关键环节。人们已经普遍认识到,纤维素生物质资源的有效生物转化对于生产可持续的化学产品极其重要。因此,为了实现纤维素原料的高效水解转化,日益增多的R&D项目已经把目光集中在探索各种自然生态系统对其转化的潜能。在各种降解生态系统中,堆肥是对有机废物高效可持续利用的一个重要反应体系。作为一个自热有氧的固态发酵过程,而定居在其中的微生物群落对于降解有机废物发挥了主导作用。很多研究表明,堆肥过程中微生物群落不断地适应营养和环境条件的变化,从而形成特定的交替演化过程。虽然与其它废弃物处理堆肥不同,用于大规模蘑菇生产的农业废料处理过程控制比较严格,包括一次发酵(phase Ⅰ)和巴氏灭菌及降温(phase Ⅱ),但这种蘑菇堆肥过程同样涉及到纤维素底物的广泛降解,但目前人们对蘑菇堆肥过程中的微生物群落了解得还不够透彻,仅有的一些使用未培养技术的研究主要集中在蘑菇堆肥不同阶段中的细菌上。除了堆肥之外,反刍动物的瘤胃由于其高效的纤维素降解能力同样得到了研究者的广泛关注。瘤胃是一种典型的厌氧生境,是研究木质纤维素在厌氧条件下降解过程的一种很好的实验体系。瘤胃中有很多瘤胃微生物可以通过分解代谢将秸秆中的纤维素、半纤维素和果胶等多糖类物质降解成单糖,并将其转化为挥发性的脂肪酸和二氧化碳等。因此,瘤胃微生物是牛生存必不可少的组成部分,其菌群结构和菌群数量上的变化直接影响着牛的消化机能,与宿主的营养状况及健康状态密切相关,所以对瘤胃微生物及其代谢的研究对于畜牧业的发展也具有重要的意义。目前人们对瘤胃中的微生物群落组成了解得还不够透彻,较早的研究主要是从瘤胃中分离培养纤维素降解微生物,而且绝大多数研究把目光集中在瘤胃中的细菌或者古菌群落。在本文中,我们通过不依赖微生物培养的测序方法,较为系统地研究了蘑菇堆肥和鲁西黄牛瘤胃这两种纤维素活跃降解的生境中特定微生物群落的物种多样性和功能多样性。一、蘑菇堆肥生产过程中微生物群落的多样性和动态变化蘑菇堆肥生产代表了一类独特的有机废物处理过程,但我们对该堆肥过程中涉及的复杂微生物类群的了解仍然有限。我们研究了用于蘑菇生产的小麦秸秆堆肥过程中三种重要的微生物类群的组成及演替,包括放线菌、真菌和梭菌。结果显示,放线菌群落在整个堆肥过程中具有较高的多样性。真菌群落的多样性在堆肥高温阶段更为丰富,但在成熟堆肥中急剧减少。我们仅在高温期和成熟期堆肥中检测到了降解纤维素的梭菌。此外,我们还发现放线菌和真菌在堆肥过程中都呈现出明显的演替,两者的群落结构在堆肥过程的不同阶段均发生了剧烈的变化。值得注意的是,以Thermopolyspora和Microbispora为代表的一些降解纤维素的放线菌属和以Humicola为代表的一些降解纤维素的真菌属在成熟堆肥中得到了高度富集。二、蘑菇堆肥生产过程中纤维素降解微生物的多样性和动态变化同时我们以Ce17A和GH48家族序列作为纤维二糖水解酶的标签,研究了纤维素降解相关的微生物。结果发现产外切纤维素酶的放线菌在堆肥所有阶段中多样性都很丰富,尤其是堆肥成熟阶段,而且其随着堆肥过程发生了变化。另外,有相当比例的GH48基因序列不能划分到任何已知的分类单元中,从而形成了新的放线菌GH48类群。与降解纤维素的放线菌相比,仅在堆肥的特定阶段检测到了产外切酶的梭菌和真菌。与梭菌类群Ⅲ仅在一次发酵和成熟堆肥中出现的结果一致,梭菌GH48基因同样是在这两个阶段能够检测到。与降解纤维素的放线菌情况一样,在成熟期堆肥中降解纤维素的梭菌的多样性明显增加。降解纤维素的真菌群落在堆肥初始阶段多样性最丰富,而在堆肥高温阶段没有被检测到,可能是由于温度太高。与降解纤维素的放线菌和梭菌相比,降解纤维素的真菌在成熟堆肥中多样性急剧下降。在成熟堆肥中检测到的两个OTU都很接近子囊菌Humicola grisea Cel7A,突出表明在后续的蘑菇生长阶段这个菌种可能发挥了重要的作用。总之,尽管纤维素底物在整个堆肥过程中始终存在,降解纤维素的微生物群落与总的微生物群落一样呈现出相似的演替变化,一个高效的纤维素降解群落可能在堆肥熟化过程中形成,对蘑菇的生长产生了有利的影响。而且通过挖掘这种独特的资源,这些丰富多样的纤维素降解微生物对于发掘新颖和高效的木质纤维素降解酶拥有巨大的潜力。三、牛瘤胃样品中微生物丰度分析我们在牛进食后不同时间点分别取瘤胃样品,测定发现样品中可溶性还原糖的含量随着牛进食时间逐渐降低,在12h降至较低水平。在基因组水平上对其中的细菌rDNA和厌氧真菌ITS序列拷贝数的定量检测结果表明两者均随着牛进食时间持续增加,在12h达到较高的水平,而且在取样的各时间点上细菌的拷贝数是真菌的10-20倍。为了初步了解牛瘤胃样品中纤维素酶功能基因随时间的变化,我们还选取了厌氧真菌特异性GH6家族基因(GH6-AF)类群作为代表进行检测。结果表明,其两个子类群GH6-AFa和GH6-AFb的总体变化趋势相似,在8h之前处于较低水平,8h～12h之间明显增加,24h时两类群都已处于较高水平,而且在各时间点上GH6-AFa的转录量是GH6-AFb的30-250倍。值得注意的是,GH6-AF类群基因的诱导转录相比于厌氧真菌菌群的变化有一个明显的延迟,这很可能与草料中的可溶性还原糖含量有关。此外,我们还尝试对能够吸附纤维素的微生物进行富集,定量结果表明纤维吸附样品中厌氧真菌和细菌都得到了明显的富集,而原生动物明显减少。上述工作所获得的关于牛瘤胃样品中微生物群落的初步信息及所建立的相关技术方法为后续高通量测序分析奠定了基础。四、通过焦磷酸测序技术研究鲁西黄牛瘤胃生境中的微生物物种多样性我们选用Roche454高通量测序平台,基于细菌16S rDNA和真菌ITS序列对牛瘤胃12h总样品和纤维吸附样品中的微生物群落结构进行了分析。经统计,两种样品测序共得到细菌有效序列85024条,产生了18781个可操作分类单元(OTU),真菌有效序列47186条,产生了4190个OTU。尽管不同样品的各微生物类群之间测序数量相差很大,但两种样品的细菌和真菌类群测序均基本达到饱和。(1)细菌类群中大部分的分类单元在牛瘤胃总样品和纤维吸附样品中都存在,两样品中丰度都比较高的细菌种类多为一些未知属,分布于Clostridiales、 Bacteroidales、Spirochaetales和Fibrobacterales这四个目中。系统发育分析表明,两样品中的细菌类群主要分布在Actinobacteria、Bacteroidetes、Firmicutes、 Proteobacteria这几个门中,其中Proteobacteria门下属的目最多但丰度都相对比较低。(2)真菌类群与细菌类群类似,大部分的分类单元在牛瘤胃总样品和纤维吸附样品中都存在。Asteromassaria、Pandora、Gibellula和Sphaerulina这四个属的真菌在总样品和纤维吸附样品中所占比例都比较大,其中Asteromassaria占据了绝对优势的地位,在总样品和纤维吸附样品中分别占21.0%和29.5%。两样品中的真菌在目水平上的分布近似,丰度最高的目均为Pleosporales,其次是Hypocreales和Entomophthorales,这三个目在两样品中所占的总比例均达到了50%以上。系统发育分析表明,两样品的真菌类群中有相当一部分属于Ascomycota门下的Dothideomycetes和Sordariomycetes纲。厌氧真菌类群中,丰度较高的两个属为Cyllamyces和Piromyces,另外还有很多未分类的厌氧真菌。五、通过宏转录组测序技术研究鲁西黄牛瘤胃生境中的微生物功能多样性为了进一步探究牛瘤胃中各种微生物类群的功能作用,我们采用Illumina HiSeqTM2500高通量测序平台对牛瘤胃总样品和纤维吸附样品中的原核生物和真核生物进行了宏转录组测序。四个文库得到的优质数据量总共为27.31G,这远超出了之前牛瘤胃宏转录组研究得到的数据量。对这些数据的基因分析预测结果发现,四个文库的348442个重叠群(contig)总共预测到了358773个ORF。尽管不同样品预测到的基因数目差别很大,但所有文库的稀释曲线均接近水平,说明目前的测序量已经接近饱和。对总样品和纤维吸附样品宏转录组测序注释到的基因所对应的微生物类群的统计结果表明,整体上注释得到的细菌和真菌类群在各自文库中所占的比例较低。由于我们更关注这两个类群微生物的多样性,所以我们分别以这两个类群单独作为整体来统计其中各分类单元的相对丰度,结果表明总样品和纤维吸附样品中的细菌和真菌群落结构差异都比较大：(1)细菌方面,两样品中的细菌主要分布于Actinomycetales、Bacteroidales、Fibrobacterales、Clostridiales、 Desulfovibrionales和Spirochaetales等这些目中。总样品中丰度最高的细菌为Prevotella属,然后是Fibrobacter、Clostridium、Desulfovibrio和Corynebacterium等属,其中只有Prevotella和Fibrobacter这两个属在纤维吸附样品中依然占据优势地位。另外,Butyrivibrio和Treponema这两个属在纤维吸附样品中丰度较高而在总样品中丰度较低,说明其在纤维吸附样品中得到了明显的富集。(2)真菌方面,总样品中的真菌类群主要由Neocallimastix、Boletus和Puccinia这几个属组成,其中只有Neocallimastix属在纤维吸附样品中依然保持较高的相对丰度,其余两个属在纤维吸附样品中没有检测到。Saccharomycetales目下的一些属和Schizosaccharomycetales目下的Schizosaccharomyces属在纤维吸附样品中得到了相对富集,这两个目均属于酵母菌。KEGG注释结果表明,无论是原核生物还是真核生物,虽然纤维吸附样品中得到注释的基因数比总样品多很多,但两种样品代谢途径的模式总体上相似,主要的代谢途径有碳水化合物代谢、翻译、能量代谢、氨基酸代谢、核苷酸代谢、信号转导和细胞膜运输等。另外,真核生物转录本中信号转导、免疫系统、转录、复制和修复等这些代谢途径在纤维吸附样品中得到了一定程度的富集。为了更深入地挖掘牛瘤胃生境中纤维素降解的相关信息,我们对糖苷水解酶家族基因、碳水化合物结合结构域序列以及转运蛋白基因进行了专门的注释和统计。四个文库中总共注释到17778条这三类序列,其中糖苷水解酶家族基因共743条,碳水化合物结合结构域序列共893条,转运蛋白基因共16142条。而且,无论是对于原核生物还是真核生物,纤维素降解相关基因在纤维吸附样品中明显得到了富集。对这三类蛋白质按照各自的家族做更为详细的分类统计目前还在进行,希望可以从中挖掘到更多的信息。