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银屑病是一种以皮肤红斑、鳞屑、浸润为主要临床表现的自身免疫性疾病。银屑病的发病与皮肤屏障功能受损密切相关,表皮紧密连接被认为是控制表皮屏障功能的“主要控制因子”。表皮细胞间紧密连接的异常可以导致其异常增殖与分化,影响正常表皮通透屏障功能,促进炎性细胞的迁移浸润及炎性因子的分泌,炎性因子又可攻击破坏紧密连接,从而形成恶性循环,维持银屑病皮损处的慢性炎症反应。银屑病血燥证多由风邪燥热久羁,阴血内耗,不能荣养皮肤所致,治宜养血滋阴,润燥解毒,养血解毒方是其有效方剂,当归是其养血组分中的主要药物,阿魏酸则是当归的主要有效成分之一。本课题将动物实验和细胞实验相结合,观察养血解毒方及其拆分方和主要成分阿魏酸对银屑病表皮通透屏障和表皮细胞间紧密连接的调节作用。以期从具有调节表皮屏障作用的细胞间连接——紧密连接功能入手,阐明养血解毒方及其主要成分治疗银屑病血燥证的作用机制,为临床应用提供生物学基础。实验一 养血解毒方对咪喹莫特诱导的银屑病样小鼠皮损及紧密连接的调节作用目的:研究养血解毒方对咪喹莫特诱导的银屑病样小鼠皮损及紧密连接的调节作用,明确养血解毒方对银屑病表皮通透屏障的修复作用,为养血解毒方治疗银屑病提供科学依据。方法:将C57BL/6J小鼠随机分为空白对照组、模型组、阳性药物(甲氨喋呤)组、养血解毒方组,每组7只,背部给予咪喹莫特涂抹诱导银屑病样皮损模型。每日记录皮损形态并进行严重程度指数(PASI)评分;水油测试笔检测皮损表皮含水量;HE染色观察其病理改变、测量表皮厚度;免疫组织荧光法检测增殖相关的核抗原(Ki67);免疫组织化学法检测表皮兜甲蛋白(Loricrin)、紧密连接蛋白(Claudin-1、Claudin-7、Occludin)表达和真皮中CD3+T淋巴细胞浸润。Western Blot法检测皮损中Claudin-7、Occludin的蛋白含量。结果:与模型组比较,养血解毒方组可显著减轻咪喹莫特诱导的小鼠银屑病样皮损表现,降低PASI评分及皮损表皮厚度(P<0.01),增加皮损区表皮水分含量(P<0.01),改善表皮Ki67、Loricrin的异常表达和真皮CD3+T细胞浸润(P<0.01),并增加紧密连接蛋白 Claudin-1、Claudin-7、Occludin 的表达(P<0.01),增加紧密连接结构的完整性。结论:养血解毒方通过调节角质形成细胞间紧密连接的表达抑制其异常的增殖分化过程,进一步恢复破坏的表皮通透屏障,可能是其治疗银屑病的作用机制之一。实验二 养血解毒方及拆分组分对HaCaT细胞间紧密连接的调节作用目的:观察养血解毒方及拆分组分对人表皮角质形成细胞(HaCaT细胞)间紧密连接蛋白(Claudin-1、Claudin-7、Occludin)表达的影响,明确养血解毒方中对紧密连接具有调节作用的组分。方法:模拟银屑病皮损微环境,建立白细胞介素-17(IL-17,1μg/ml)刺激的HaCaT细胞模型,制作养血组分、解毒组分、养血解毒方组喷干粉进行干预。采用细胞增殖毒性检测试剂盒-8(CCK-8)法检测药物对HaCaT细胞的毒性;细胞免疫荧光法检测药物对HaCaT细胞表达紧密连接蛋白Claudin-1、Claudin-7、Occludin的调节作用。结果:IL-17可以引起HaCaT细胞间紧密连接完整性的破坏,降低紧密连接蛋白表达水平。与模型组比较,养血解毒方组和养血组分组明显升高紧密连接蛋白Claudin-1、Claudin-7、Occludin的表达水平(P<0.01);与模型组比较,解毒组分组紧密连接蛋白表达水平无明显变化。结论:养血解毒方对角质形成细胞间紧密连接蛋白的调节作用主要是其中养血组分起作用。实验三 阿魏酸对咪喹莫特诱导的银屑病样小鼠皮损及表皮细胞间紧密连接的调节作用目的:基于前期实验基础,为了进一步探究养血药物对表皮细胞间紧密连接的调节作用。本研究选用中药当归的主要成分之一——阿魏酸(Ferulic Acid,FA),进一步探讨其对咪喹莫特诱导的银屑病样小鼠皮损表皮细胞间紧密连接的调节作用。方法:将BALB/c小鼠随机分为空白对照组、模型组、阳性药物(甲氨喋呤)组、阿魏酸低、中、高剂量组,每组7只,背部给予咪喹莫特涂抹诱导银屑病样皮损模型。每日记录皮损形态并进行严重程度指数(PASI)评分;水油测试笔检测皮损表皮含水量;HE染色观察其病理改变、测量表皮厚度;免疫组织荧光法检测增殖相关的核抗原(Ki67)、兜甲蛋白(Loricrin)以及紧密连接蛋白(Claudin-1、Claudin-7)的表达;免疫组织化学法检测表皮紧密连接蛋白Occludin和真皮中CD3+T淋巴细胞浸润。结果:与模型组相比,阿魏酸低、中、高三剂量组均可显著减轻小鼠银屑病样皮损表现,降低皮损PASI评分,改善皮损表皮厚度(P<0.01);阿魏酸中、高剂量组可明显升高皮损区表皮水分含量(P<0.01);阿魏酸低、中、高三剂量组均可改善表皮中Ki67、Loricrin的异常表达并增加紧密连接蛋白Claudin-1、Claudin-7、Occludin的表达(P<0.01);阿魏酸中、高剂量组可减轻真皮中CD3+T细胞浸润情况(P<0.01)。结论:阿魏酸可减轻咪喹莫特诱导的小鼠银屑病样皮损,可能与其调节角质形成细胞间紧密连接的表达抑制其异常的增殖分化过程,恢复破坏的表皮通透屏障有关。实验四 阿魏酸对HaCaT细胞间紧密连接的调节作用目的:观察阿魏酸对人表皮角质形成细胞(HaCaT细胞)间紧密连接形成的调节作用,并探讨其可能的作用机制。方法:建立白细胞介素-17(IL-17,1μg/ml)刺激的HaCaT细胞模型,加入低、中、高三种浓度阿魏酸(25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml)进行干预。采用细胞增殖毒性检测试剂盒-8(CCK-8)法检测药物对HaCaT细胞的毒性;使用Transwell板检测HaCaT细胞对荧光黄的渗透率;细胞免疫荧光法检测HaCaT细胞表达紧密连接蛋白(Claudin-1、Claudin-7、Occludin)的情况;Western Blot法检测HaCaT细胞中Cdc42、p-aPKC的表达水平。结果:IL-17可以引起HaCaT细胞间紧密连接完整性的破坏,增加HaCaT细胞对荧光黄的渗透率,降低紧密连接蛋白Claudin-1、Claudin-7、Occludin的表达水平;降低Cdc42、p-aPKC的表达水平。与模型组比较,阿魏酸高剂量组明显降低对荧光黄的渗透率(P<0.05);阿魏酸中、高剂量组可以不同程度增加紧密连接蛋白Claudin-1、Claudin-7、Occludin的表达水平,增加其网络状表达的完整性;阿魏酸高剂量组较模型组Cdc42表达水平明显升高(P<0.05),p-aPKC的表达水平也明显升高(P<0.01)。结论:阿魏酸可能通过激活Cdc42,增加aPKC磷酸化水平,促进紧密连接蛋白的表达,修复IL-17对HaCaT细胞间紧密连接的破坏。结语综上所述,咪喹莫特诱导的银屑病样小鼠皮损中存在着紧密连接完整性的破坏,Claudin-1、Claudin-7、Occludin等紧密连接蛋白表达减少,而应用养血解毒方后,咪喹莫特诱导的银屑病样小鼠皮损表现明显改善,表皮细胞的异常增殖分化情况得到改善,紧密连接蛋白的表达升高,同时反映皮肤屏障功能的表皮含水量也有所升高,提示养血解毒方可能通过调节角质形成细胞间紧密连接蛋白的表达抑制其异常的增殖分化过程,进一步恢复破坏的表皮通透屏障,这可能是其治疗银屑病的作用机制之一。细胞实验通过将养血解毒方拆分,证明了养血解毒方对表皮细胞间紧密连接蛋白的调节作用主要是其中养血组分起作用。养血组分中的代表药物阿魏酸可以通过升高Cdc42表达水平,增加aPKC磷酸化水平,增加紧密连接蛋白的表达,改善表皮通透屏障功能。这可能是临床应用养血药物治疗银屑病的药理学基础。