苏博美利奴羊毛囊发育相关LncRNA的筛选与功能分析

来源 :新疆农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:yangyuwu21
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绵羊毛囊(HF)发生涉及一系列复杂的表皮和真皮细胞间持续而复杂的信号通路。信号通路中任一配体、受体的遗传突变、表观遗传修饰以及蛋白翻译后修饰的改变等都将影响绵羊毛囊的发生。因此,我们可关注,除目前在mRNA水平关注的蛋白编码基因外的非编码长链RNA(long non-coding RNA,LncRNA)作为新型基因表达的调控因子。研究表明LncRNA对器官形成、细胞分化和疾病发生等各种生理和病理过程具有重要的调控作用,但LncRNA在毛囊形态发生中的调控作用机制还知之甚少。因此,本研究首先在组织形态学水平,通过组织切片的方法对苏博美利奴羊65天、85天、105天和135天胎儿以及出生后7天和30天羔羊肩胛部皮肤组织进行组织形态学研究,旨在探明形态变化规律及毛囊结构,为研究毛囊生长发育及其调控机制提供可靠的组织学基础。此外,在转录组水平对这6个时期的18个cDNA文库进行了 RNA-seq测序,进一步利用分析软件并结合生物信息学方法,对绵羊差异表达LncRNA进行筛选,LncRNA靶基因进行预测,对靶基因进行GO和KEGG富集分析,并通过实时荧光定量PCR技术对深度测序获得的LncRNA和mRNA进行了试验验证,探讨LncRNA在细毛羊毛囊发生中的作用机理。最后在细胞水平,对与毛囊发育相关的TCONS00202353、TCONS00453233、TCONS00428783、SFRP2、DKK1以及Hoxc13进行分析。主要结果如下:(1)组织形态学研究结果显示,苏博美利奴羊在胎龄65天时形成完整的皮肤结构,初级毛囊开始发生形成毛芽;胎龄85天时初级毛囊数量迅速增加,次级毛囊开始发生;胎龄105天时次级毛囊数量也迅速增加,在原始次级毛囊开始分化出再分化次级毛囊,在头部可见穿出体表的毛干;胎龄135天时大多数初级毛囊及一部分次级毛囊基本成熟,各部位均出现穿出体表的毛干:出生后7~30天时次级毛囊继续发育及成熟。(2)在转录组水平对18个cDNA文库进行高通量测序后,共获得1,847,973012条原始序列读数(raw reads)。经过各种质量控制程序处理后,共得到1,726,188919条高质量序列读数(即mappable reads)。与基因组比对,整体比对率≥81%,进一步筛选后共获得1,0193个LncRNA转录本;其中,8653个新预测的LncRNA,1540个已知LncRNA。在毛囊发育6个不同时期中共检测了 471个差异表达的LncRNA;通过对差异LncRNA进行靶基因预测发现,一共有3687顺式作用的靶基因以及1722反式作用的靶基因。功能富集分析发现,将471个差异LncRNA靶基因富集到5509个GO term以及268个Pathway中。感兴趣的是我们发现 3 对 lncRNA-靶基因(TCONS00202353-SFRP2、TCONS00453233-DKK1、TCONS00428783-Hoxc13)可能影响苏博美利奴羊毛囊发育及形态变化。通过实时荧光定量PCR技术对10个差异LncRNA和4个mRNA进行了试验验证。结果表明这些LncRNA和mRNA的表达趋势与RNA-seq结果一致。(3)功能研究结果显示,过表达TCONS00202353会极显著降低SFRP2基因的表达;通过双荧光素酶报告系统验证TCONS00202353和SFRP2之间存在靶标关系。CCK8、克隆形成和流式细胞术实验结果显示,TCONS00202353对绵羊成纤维细胞增殖及凋亡有促进作用,这说明TCONS00202353可以调控苏博美利奴羊毛囊发育。本研究进行的绵羊组织形态学、LncRNA转录组的鉴定以及功能分析,将进一步促进绵羊LncRNA功能和基因调控机制的研究。
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