乳腺癌(Breast cancer)是全球女性中最常见的癌症,也是女性癌症相关死亡的主要原因。根据GLOBOCAN 2018年的数据,仅乳腺癌就占所有癌症病例的24.2%,占女性癌症死亡的15.0%。目前,影像学检查和活检是常用乳腺癌诊断方法,但是也具有一定的致癌风险和创伤性,这在一定程度上限制了其在乳腺癌早期筛查中的应用。血清中抗肿瘤相关抗原(Tumor associated antigen,TAA)的自身抗体(Autoantibody)能够在血清中稳定持续地存在,可作为一种血清学肿瘤标志物,弥补上述不足。采用蛋白质芯片技术筛选一组具有较高灵敏度、特异度的自身抗体组合,为研发一种经济适用的乳腺癌诊断试剂盒奠定基础,这对乳腺癌临床检测具有重要意义。目的本研究旨在使用癌症驱动基因编码的蛋白质定制蛋白芯片,筛选鉴定潜在的乳腺癌TAAs,继而使用酶联免疫吸附试验(ELISA),在较大样本中检测抗-TAAs自身抗体水平,评价这些自身抗体对乳腺癌的诊断价值。建立并验证多指标联合诊断模型,以期用优化的抗-TAAs自身抗体组合来更好地区分乳腺癌与健康对照以及良性乳腺疾病,为早期乳腺癌筛查建立一种新的非侵袭性血清学免疫诊断方法提供理论依据和技术支持。方法1.利用蛋白质芯片技术初步筛选TAAs:基于138种癌症驱动基因编码的154种蛋白质构建定制蛋白质芯片,利用27例乳腺癌患者和27例年龄性别匹配的健康对照血清与该蛋白质芯片反应,采用非参数检验、受试者工作特征曲线(ROC)分析、逻辑回归等方法,初步筛选与乳腺癌患者血清高反应性的蛋白,即潜在的TAAs。2.使用间接酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清抗-TAAs自身抗体:1)小样本初步检测:按照病例对照研究设计,使用间接ELISA方法,初步检测120例乳腺癌患者和年龄性别匹配的120例健康对照血清中抗-TAAs自身抗体水平。使用非参数检验比较乳腺癌组和健康对照组血清中抗-TAAs自身抗体水平差异,采用χ2检验比较自身抗体在两组阳性率的差异。采用ROC分析评价这些差异表达的自身抗体对乳腺癌的诊断价值。2)大样本验证.:使用间接ELISA方法,进一步在758例大样本人群血清中验证上一步检测有显著性差异的抗-TAAs自身抗体水平。大样本由279例乳腺癌、279例健康对照及200例乳腺良性疾病组成。采用非参数检验比较三组之间抗-TAAs自身抗体水平的差异,采用χ2检验比较三组自身抗体阳性率的差异,使用Bonferroni方法校正α值,当P<0.0167时认为三组相互之间差异是有统计学意义的。单个抗-TAAs自身抗体对乳腺癌的诊断价值用ROC分析来评价。3.采用重复测量方差分析比较乳腺癌患者手术前后血清中抗-TAAs自身抗体含量的差异。4.乳腺癌诊断模型的建立与验证1)建立模型:基于上述大样本验证中的558例研究对象(279例乳腺癌,279例健康对照)作为训练集,以上述验证有意义的抗-TAAs自身抗体水平为自变量,在训练集中应用十折交叉验证分别对逻辑回归(logistic regression)和随机森林(random forest,RF)两种分类器进行评估,选择符合率高的分类器,在训练集中进行建模,然后采用ROC分析评价该模型对训练集中乳腺癌患者的诊断价值。2)验证模型:基于小样本检测的240例研究对象作为测试集,验证上述在训练集中构建的乳腺癌诊断模型。采用ROC分析评价该模型对测试集中乳腺癌患者的诊断价值。3)模型对乳腺癌和乳腺良性疾病的区分能力:合并小样本检测和大样本验证两个阶段的所有乳腺癌患者,使用ROC分析评估上述模型对乳腺癌和乳腺良性疾病的鉴别能力。4)模型对乳腺癌临床亚组的诊断价值:采用χ2检验比较该模型在诊断乳腺癌患者不同的临床分期、激素水平、不同的年龄阶段、淋巴结转移与否和组织学类型的临床亚组之间自身抗体阳性率的差异,并通过计算灵敏度、特异度、约登指数、符合率等评价该模型对乳腺癌患者各亚组的诊断价值。结果1.定制蛋白芯片结果:利用蛋白质芯片技术,通过多种统计学方法,筛选出了 16 种潜在的 TAAs:ALK、BRCA2、CDKN2A、CEBPA、CEP55、CSF1R、FGFR3、FUBP1、GATA3、GNAS、HIST1H3B、HRAS、PTCH1、p62(IMP2)、RalA、SRSF2,它们区分乳腺癌与健康对照的AUC范围为0.613～0.734,灵敏度范围为18.5%～48.2%,特异度均为92.6%。2.ELISA检测抗-TAAs自身抗体结果:通过ELISA对16种潜在的TAAs进行检测和验证其自身抗体后,最终筛选出12种(ALK、BRCA2、CDKN2A、CEBPA、CEP55、FUBP1、GATA3、HIST1H3B、HRAS、PTCH1、p62(IMP2)、Ra1A)在乳腺癌患者血清中高表达的抗-TAAs自身抗体。当正常血清为对照组时,12种抗-TAAs自身抗体诊断乳腺癌的AUC范围是0.593～0.769,当良性乳腺疾病为对照组时,其诊断AUC范围为0.530～0.736。12种抗-TAAs自身抗体阳性率范围在乳腺癌组为15.8%～59.2%,在健康对照组为9.7%～11.7%,在良性乳腺疾病组为6.5%～27.0%。3.乳腺癌患者手术前后血清抗-TAAs自身抗体比较结果:12种抗-TAAs自身抗体(ALK、BRCA2、CDKN2A、CEBPA、CEP55、FUBP1、GATA3、HIST1H3B、HRAS、PTCH1、p62(IMP2)、RalA)在未经过任何治疗的乳腺癌患者血清中的相对浓度中位数依次分别为 22.1ng/ml、18.1ng/ml、28.0ng/ml、27.1ng/ml、25.9ng/ml、28.9ng/ml、18.4ng/ml、20.6ng/ml、23.8ng/ml、28.8ng/ml、20.1ng/ml、33.1ng/ml,在这些患者术后一个月内的血清相对浓度中位数分别为19.5ng/ml、11.7ng/ml、20.2ng/ml、18.4ng/ml、14.2ng/ml、16.7ng/ml、13.4ng/ml、17.5ng/ml、19.5ng/ml、16.2ng/ml、15.3ng/ml、23.7ng/ml,术后与术前比较,差异具有显著性(P<0.05),未经过任何治疗的乳腺癌患者血清中12种抗-TAAs自身抗体的水平在术后一个月内下降。4.建立多指标联合诊断模型结果:经十折交叉验证后,选择符合率高的随机森林分类器在训练集中进行建模,基于筛选出的12种抗-TAAs自身抗体,建立并验证了由 6 种抗-TAAs 自身抗体(BRCA2、CEBPA、CEP55、FUBP1、HRAS和RalA)组合的乳腺癌诊断模型,该模型对训练集的乳腺癌患者诊断AUC为0.878(95%CI:0.846-0.915),灵敏度特异度分别为75.6%和90.0%。对测试集的乳腺癌患者的诊断AUC为0.858(95%CI:0.823-0.901),灵敏度为66.0%,特异度为91.4%。当合并训练集乳腺癌患者和测试集乳腺癌患者,以良性乳腺疾病患者为对照时,该模型区分二者的AUC为0.860(95%CI:0.841-0.902),诊断灵敏度为70.5%,特异度为90.0%。对乳腺癌各亚组分析结果显示,该诊断模型在诊断乳腺癌患者不同的临床分期、不同的年龄阶段、淋巴结转移与否和组织学类型亚组中的自身抗体阳性率之间差异无统计学意义(P>0.05),而在HER-2阳性和阴性乳腺癌患者中的阳性率(44.1%vs 69.8%)差异有显著性(P=0.017)。结论1.基于138种癌症驱动基因编码的154种蛋白定制蛋白芯片,筛选出了 16种潜在的TAAs,并经过大样本进一步检测和验证其自身抗体后,最终从中筛选出 12 种 TAAs(ALK、BRCA2、CDKN2A、CEBPA、CEP55、FUBP1、GATA3、HIST1H3B、HRAS、PTCH1、p62(IMP2)、RalA),并且这 12 种 TAAs 的自身抗体均对乳腺癌有一定诊断价值。2.乳腺癌患者术后一个月内抗-TAAs自身抗体水平较术前显著下降。3.基于建模方法,建立了 6 种抗-TAAs(BRCA2、CEBPA、CEP55、FUBP1、HRAS和RalA)自身抗体组合的随机森林诊断模型,对乳腺癌和健康对照或者良性乳腺疾病有较高的区分能力。